Preparo de plasmídeos - Microplacas - Histórico de revisão

Leon: /* MINI-PREP EM MICROPLACAS */

2012-04-02T14:57:44Z

MINI-PREP EM MICROPLACAS

Leon: /* SOLUÇÕES */

2012-04-02T14:56:14Z

SOLUÇÕES

Leon: /* MINI-PREP EM MICROPLACAS */

2012-04-02T14:55:49Z

MINI-PREP EM MICROPLACAS

Leon: /* MINI-PREP EM MICROPLACAS */

2012-04-02T14:31:20Z

MINI-PREP EM MICROPLACAS

Leon em 11h44min de 5 de setembro de 2011

2011-09-05T11:44:14Z

Leon em 11h43min de 5 de setembro de 2011

2011-09-05T11:43:44Z

Leon em 11h37min de 5 de setembro de 2011

2011-09-05T11:37:49Z

Leon: /* PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS(96-well)Crescimento */

2011-09-05T11:26:58Z

PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS(96-well)Crescimento

Leon: Criou página com ';CUIDADOS ESPECIAIS :Observar atentamente a orientação das placas. :Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes. :Etiquetar cada...'

2011-09-05T11:26:43Z

Criou página com ';CUIDADOS ESPECIAIS :Observar atentamente a orientação das placas. :Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes. :Etiquetar cada...'

Nova página

;CUIDADOS ESPECIAIS
:Observar atentamente a orientação das placas.
:Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes.
:Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência.

==PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS(96-well)Crescimento==

'''Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)'''

#Encher cada poço de um bloco de crescimento de 96 poços com 1,0 mL de meio Circle Grow contendo o antibiótico adequado, se necessário.
#*250 mL de meio é suficiente para duas placas
#Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo
Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 L de estoque para 1 mL de meio)
#Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA)
#Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC

;Marcar a placa com fita crepe contendo:
:Nome do responsável
:Nº da placa
:Biblioteca.
:'''Selar a placa com adesivo'''

==MINI-PREP EM MICROPLACAS==

#Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado
#*1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro
#*Fixar com fita adesiva, uma placa Millipore (MAGV N22) no topo de uma microplaca de fundo em “V” de 250 µL de polipropileno. Verificar se os poços estão alinhados.
#Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA
#Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
#Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
#Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
#Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de GET + células para uma placa de fundo U
#Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células.
#Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min.
#Adicionar a cada poço 80 µL de GET já contendo RNAse (preparar 20 mL de GET + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
#Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
#Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1%
#*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser estocada
#*1 mL NaOH 4M + 2 mL SDS 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
#*Não pode ser adicionada uma solução de NaOH após SDS 10%, use água como intermediário.
#Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
#*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.
#Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo.
#Adicionar a cada poço 80 µL de acetato de potássio 3M (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão
#Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm.
#Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo
#Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min.
#Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC
#Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”).
#*Caso centrifugada por muito mais de 5 min a 4000rpm a placa Millipore corre o risco de rachar.
#Remover e descartar a placa Millipore. Adicionar 100 µL de Isopropanol ao filtrado (que está na microplaca de fundo V)
#Selar bem a placa com novo adesivo (resistente a álcool) e misturar 30 vezes por inversão.
#Centrifugar por 45 min, 4000 rpm, 20ºC.
#Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante (invertendo a placa)
#Adicione 200 µL de Etanol 70% gelado.
#Centrifugar por 5 min, 4000 rpm a 20ºC. Remova o sobrenadante.
#Inverter a placa sobre papel absorvente e pulsar, 600 rpm, 20ºC.
#Deixar a placa secar em TA por 60 min, coberta com papel toalha.
#Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’.
#Guardar placa no freezer – 20oC.

==SOLUÇÕES==
;GET
:Glicose 50 mM filtrada
:EDTA 10mM pH 8,0
:Tris-HCl 25 mM pH 7,4
:;Para 500 mL:
::10 mL de EDTA 0,5M + 12,5 mL de Tris-HCl 1M + 22,5 mL glicose 20% + H2O q.s.p. 500 mL;
:Autoclavar 121 °C; 15 min

;SDS - NaOH
:SDS 10% - 300 ?L
:NaOH 4M – 150 ?L
:H2O q.s.p. 3 mL

;Acetato de potássio 3M (KOAc)
:Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g)
:Ácido acético glacial – 11,5 mL
:H2O Milli-Q autoclavada q.s.p. 100 mL
:Filtrar em papel de filtro com funil;
:Armazenar a solução em frasco de plástico

:;Para preparar a solução estoque de Acetato de Potassio 5 M:
::246,87 g de KOAc em H2O q.s.p. para 500 mL.
::Filtrar em papel de filtro

@@ Linha 69: / Linha 69: @@
 ;<div id="SDS-NAOH">SDS - NaOH</div>
-:SDS 10% - 300 ?L
+:SDS 10% - 300 uL
-:NaOH 4M – 150 ?L
+:NaOH 4M – 150 uL
 :H2O q.s.p. 3 mL

@@ Linha 34: / Linha 34: @@
 #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#GET|GET]] já contendo RNAse  (preparar 20 mL de [[#GET|GET]] + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
-#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 1%
+#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|SDS]] 1%
 #*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser  estocada
-#*1 mL [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
+#*1 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|SDS]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
-#*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] após [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 10%, use água como intermediário.
+#*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|NaOH]] após [[#SDS-NAOH|SDS]] 10%, use água como intermediário.
 #Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
 #*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.

@@ Linha 34: / Linha 34: @@
 #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#GET|GET]] já contendo RNAse  (preparar 20 mL de [[#GET|GET]] + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
-#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|NaOH]] 1%
+#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 1%
 #*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser  estocada
-#*1 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
+#*1 mL [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
-#*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|NaOH]] após [[#SDS-NAOH|NaOH]] 10%, use água como intermediário.
+#*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] após [[#SDS-NAOH|SDS-NaOH]] 10%, use água como intermediário.
 #Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
 #*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.

@@ Linha 28: / Linha 28: @@
 #Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
 #Adicionar a cada poço 240 µL de [[#GET|GET]], selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
 #Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células.
 #Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min.
 #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#GET|GET]] já contendo RNAse  (preparar 20 mL de [[#GET|GET]] + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
 #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|SDS]] 1%
 #*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser  estocada

@@ Linha 11: / Linha 11: @@
 #*250 mL de meio é suficiente para duas placas
 #Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo
-Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 L de estoque para 1 mL de meio)
+Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 uL de estoque para 1 mL de meio)
 #Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA)
 #Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC

@@ Linha 22: / Linha 22: @@
 ==MINI-PREP EM MICROPLACAS==
 #Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado
 #*1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro
@@ Linha 28: / Linha 27: @@
 #Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA
 #Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
-#Adicionar a cada poço 240 µL de [[#GET]], selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
+#Adicionar a cada poço 240 µL de [[#GET|GET]], selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
-#Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de GET + células para uma placa de fundo U
+#Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de [[#GET|GET]] + células para uma placa de fundo U
 #Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células.
 #Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min.
-#Adicionar a cada poço 80 µL de GET já contendo RNAse  (preparar 20 mL de GET + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
+#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#GET|GET]] já contendo RNAse  (preparar 20 mL de [[#GET|GET]] + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
-#Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1%
+#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|NaOH]] 1%
 #*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser  estocada
-#*1 mL NaOH 4M + 2 mL SDS 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
+#*1 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
-#*Não pode ser adicionada uma solução de NaOH após SDS 10%, use água como intermediário.
+#*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|NaOH]] após [[#SDS-NAOH|NaOH]] 10%, use água como intermediário.
 #Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
 #*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.
 #Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo.
-#Adicionar a cada poço 80 µL de acetato de potássio 3M (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão
+#Adicionar a cada poço 80 µL de [[#ACETATO| acetato de potássio 3M]] (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão
 #Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo
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 #Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’.
 #Guardar placa no freezer – 20oC.
 ==SOLUÇÕES==
@@ Linha 70: / Linha 68: @@
 :Autoclavar 121 °C; 15 min
-;SDS - NaOH
+;<div id="SDS-NAOH">SDS - NaOH</div>
 :SDS 10% - 300 ?L
 :NaOH 4M – 150 ?L
 :H2O q.s.p. 3 mL
-;Acetato de potássio 3M (KOAc)
+;<div id="ACETATO">Acetato de potássio 3M (KOAc)</div>
 :Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g)
 :Ácido acético glacial – 11,5 mL

@@ Linha 28: / Linha 28: @@
 #Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA
 #Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
-#Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
+#Adicionar a cada poço 240 µL de [[#GET]], selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
 #Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de GET + células para uma placa de fundo U
@@ Linha 45: / Linha 45: @@
 #Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm.
 #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo
-#Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min.
+#Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por '''EXATOS''' 30 min.
 #Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC
 #Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”).
@@ Linha 62: / Linha 62: @@
 ==SOLUÇÕES==
-;GET
+;<div id="GET">GET</div>
 :Glicose 50 mM filtrada
 :EDTA 10mM pH 8,0

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 :Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência.
-==PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS(96-well)Crescimento==
+==PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS (96-well) Crescimento==
 '''Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)'''