Tampões e soluções

Edição de 09h13min de 13 de fevereiro de 2012

TAMPÃO FOSFATO: Dica! Ver: https://www.msu.edu/~eisthen/lab/methods/anatomy/recipes/PB.html

OUTROS TAMPÕES E SOLUÇÕES - BIOLOGIA MOLECULAR (fonte: http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/apostilacurso_molecular.pdf) 1.PREPARO DE SOLUÇÕES Soluções para extração de DNA Solução estoque de Tris-HCl 1M A solução foi preparada dissolvendo-se 121,10g de Trizma base (Tris [hidroximetil] amino metano) (Sigma: T-1503) em aproximadamente 800mL de água bidestilada (Milli-Q). O pH foi ajustado para 8,0 ( ou 7,5, quando necessário), com HCl concentrado (aproximadamente 40mL) e o volume final completado para 1000mL com água bidestilada. A solução foi distribuída em frascos (100mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados à temperatura ambiente. Solução estoque de NaCl 5M A solução foi preparada dissolvendo-se 292,24g de NaCl em 1000mL de água bidestilada (q.s.p.). A solução foi distribuída em frascos (100 mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados à temperatura ambiente. Solução estoque de EDTA 0,5 M (pH 7,5 ou 8,0) A solução foi preparada dissolvendo-se 186,10g de EDTA (Sigma: E-5134) em 800mL de água bidestilada, sendo a mesma titulada com NaOH sólido (aproximadamente 20,00g) até atingir o pH desejado (7,5 ou 8,0). Após a dissolução completa do EDTA, o volume foi completado para 1000mL com água bidestilada. A solução foi distribuída em frascos (100mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados à temperatura ambiente. SDS 10% (detergente) A solução foi preparada dissolvendo-se 10g de SDS em aproximadamente 80mL de água bidestilada aquecida. Após a dissolução completa do SDS, a solução foi resfriada e o volume completado para 100mL com água bidestilada. 50 A solução foi estocada à temperatura ambiente, não sendo necessária a esterilização. ( O SDS precipita ao ser colocado em refrigerador). Fenol Saturado Foram dissolvidos 50,00g de fenol cristalizado (Synth) embanho- maria a 65°C durante 5 a 6 horas e adicionando um volume de tampão Tris HCl 0,5 M pH 8,0. A solução foi submetida a agitação durante 30 minutos, a fim de equilibrar o pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M pH 8,0. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume final de tampão Tris HCl 0,1 M pH 8,0 e estocado em frasco escuro a 4°C. 1- Remover o fenol do freezer. Esperar atingir a temperatura ambiente. Derretê-lo (50g) em banho-maria (65°C) dentro de um béquer. Manter o frasco com a tampa levemente fechada. 2- Ao fenol liquefeito, adicionar o volume igual de Tris HCl 0,5 M pH 8,0. Colocar em erlenmeyer. 3- Agitar a solução em agitador magnetico por 30 minutos para equilibrar o pH. Cobrir o frasco todo com papel aluminio para evitar a oxidação do fenol. Após 30 minutos, desligar o agitador e transferir o fenol para uma proveta. Quando as duas fases se separarem, aspirar a fase aquosa superior (Tris-HCl 0,5 M) e descartá-la. 4- Repetir o procedimento com Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. Após a separação a fase aquosa ficou em cima e a fenolica embaixo. 5- Repetir o procedimento até a fase fenólica apresentar pH> que 7,8. Utilizar o papel medidor de pH. 6- Remover a fase aquosa final. Adicionar 1/10 volume de Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 e hidroxiquinolina a 0,1% do volume de fenol. Estocara 4°C em frasco escuro. TRIS HCl 0,5 M Ph 8,0- Diluiu-se a solução de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em água bidestilada na proporção de 1:1. 51 TRIS HCl 0,1 M pH 8,0- Diluiu-se a solução de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em água bidestilada na proporção de 1:10. CLOROFANE Este foi obtido a partir da mistura de um volume de fenol a aproximadamente um volume de clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1). ETANOL 70% Álcool Etílico....................................................342mL Água destilada..................................................58mL TAMPÃO TRIS-EDTA (TE) TRIS-HCl 1M pH 7,5.........................................10mL EDTA 0,5M pH 8,0............................................ 2mL O volume foi completado para 1000 mL com água bidestilada e a solução esterilizada. RNase A RNase pancreatica (RNase A) foi preparada na concentração de 10mg/mL, em 10mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 15 mM de NaCl. A solução foi aquecida em banho-maria a 98°C por 15 minutos e estocada a -20°C. Tris-HCl 10mM=Tris-HCl 0,01M Tris-HCl 1M⇒Tris-HCl 0,01 M  (diluir 100x) =  1mL de Tris-HCl 1 M + 99mL de água bidestilada NaCl 15 mM = NaCl 0,015 M Na Cl 1M ⇒ 58,45g NaCl 0,015 ⇒ 0,877g em 1000,00 mL 0,00877g de NaCl em 10,00mL de Tris-HCl 0,01M 52 ⇒0,01g de RNase em 1,0mL de solução Tris-HCl/NaCl Soluções para eletroforese Solução Estoque de brometo de Etídio- 10mg/mL Foi dissolvido 1% (p/v) de brometo de etídio em água destilada, agitado durante 1 hora e estocado à temperatura ambiente ou refrigerador em um frasco âmbar. No momento do uso, 3µL desta solução foram adicionados à 100mL de tampão TEB 1X. Brometo de etídio: 1% = 1g em 100,00mL de água destilada= 0,01g/mL = 10mg/mL Em 1,0mL de água destilada, teremos 0,01g ou 10mg de brometo de etídio TAMPÃO TRIS-BORATO-EDTA (TBE) - 10X - Tampão de Corrida Trisma base.....................................................108g Ácido Bórico.................................................... 55g EDTA 0,5 M (pH 8,0)...................................... 40mL O volume foi acertado para 1000mL com água destilada, deionizada e filtrada em filtro Milli-Q (água Milli-Q). o tampão foi autoclavado e mantido a 4°C. No momento do uso, o mesmo foi diluído com água Milli-Q para a obtenção da concentração desejada.(0,5X ou 1,0X). TEB 1X⇒Diluir o tampão TEB 10X na proporção de 1:10 em água Milli-Q. 1volume de tampão TEB 10X : 9 volumes de água Milli-Q. 100mL de tampão TEB 10X : 900mL de água Milli-Q. 200mL de tampão TEB 10X : 1800mL de água Milli-Q. 53 TAMPÃO DE AMOSTRA Este tampão foi preparado a partir de uma solução de glicerol 30% em água destilada, à qual adicionou-se azul de bromofenol (0,25%), sendo a solução final estocada sob refrigeração. No momento de uso, um volume deste tampão ( equivalente a 10%do volume da amostra a ser aplicada no gel de agarose) é colocado sobre papel parafilm, e a esse adicionado o volume correspondente a amostra. Ambos são homogeneizados e aplicados na canaleta do gel de agarose com uma micropipeta. Exemplo: amostra a ser aplicada no gel de agarose - 20,0µL tampão de amostra - 2,0µL GEL DE AGAROSE 0,8% (para verificar a integridade do DNA) Agarose (Sigma A-0169/Pharmacia/GIBCO)........................0,8g TEB 1X.............................................................................100mL Pesar a agarose em um Erlenmeyer e diluí-la em tampão TEB 1X. Ferver no microondas durante aproximadamente 3 minutos (ou mais)na potência média, pausando a cada 30 segundos, agitando levemente o frasco, a fim de homogeneizar a agarose. OBS: Medir o peso antes e após a fervura. Corrigir o peso, completando com água Milli-Q. OBS: A agarose dissolvida (após a fervura) deve ser resfriada até 50-60°C, e a seguir, vertida sobre a placa de eletroforese. Deixar a agarose se polimerizar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 54 Soluções para hibridização 1- Tampão de Desnaturação(0,5 N NaOH; 1,5 M NaCl), para 1 Litro: • 20,0 g NaOH • 87,66 g NaCl • Dissolver em 800 mL de H2 O MilliQ e completar o volume p/ 1 Litro. 2- Tampão de Neutralização(1 M Tris-Cl; 1,5 M NaCl), para 1 Litro: • 121,14 g Tris-Cl, pH 7,5 (Tris-base) • 87,66 g NaCl • Dissolver em 800 mL de H2 O MilliQ, ajustar pH 7,5 com HCl e completar o volume para 1 Litro. 3- 20X SSC(3 M NaCl; 0,3 M Citrato de sódio), para 1 Litro: • 175,3 g NaCl • 88,2 g Citrato de Sódio • Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 7,0 com HCl, completar o volume para 1 Litro e autoclavar. 4- Washing Buffer I(10% de Blocking Solution), p/ 1 Litro: • 100 mL Blocking Solution • 900 mL de H2O MilliQ 5- 10X Washing Buffer II(100 mM Tris-Cl; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl 2 ), p/ 1 Litro: • 12,1 g Tris-Cl (Tris base) 55 • 5,8 g NaCl • 2,0 g MgCl2 • Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 9,5 com HCl, completar o volume para 1 Litro. • Estocar 4° C. 6- Blocking Solution(5% SDS; Phosphate, pH 7,2{17 mM Na 2HPO4, 8 mM NaH2PO4 };125 mM NaCl), para 1 Litro: • 7,3 g NaCl • 2,4 g Na2HPO4 (dibásico) • 1,0 g NaH2PO4 ( monobásico) • 50 g SDS • Dissolver em 800 mL de H2 O e ajustar o volume para 1 Litro. 7 -0,1 X SSC, 0,1 % SDS, p/ 1 Litro: • 10 ml SDS 10 % • 5 ml 20 X SSC • Completar para 1 Litro com H2 O MilliQ. 8-2 X SSC, 0,1% SDS, p/ 1 Litro: • 100 ml 20 X SSC • 10 ml SDS 10 % • Completar para 1 Litro com H2 O MilliQ. 9-0,4 N NaOH, 0,1% SDS, p/ 1 Litro: • 16 g NaOH • 1 g SDS (ou 10 mL da solução SDS 10%) • Completar o volume para 1 Litro com H2 O MilliQ. 56 10-0,2 M Tris-HCl, 0,1X SSC, p/ 1 litro: • 200 mL Tris-HCl, pH 7,5 (tris base) • 5 mL 20X SSC • Completar o volume para 1 Litro com H2 O MilliQ. 11-4 M LiCl(Cloreto de lítio), p/ 100 mL: • 17 g Cloreto de lítio • Dissolver em 80 mL de H2 O MilliQ, completar o volume p/ 100 mL. • Autoclavar e guardar na geladeira (4° C).