|
|
| Linha 3: |
Linha 3: |
| | Ver: https://www.msu.edu/~eisthen/lab/methods/anatomy/recipes/PB.html | | Ver: https://www.msu.edu/~eisthen/lab/methods/anatomy/recipes/PB.html |
| | | | |
| − | OUTROS TAMPÕES E SOLUÇÕES - BIOLOGIA MOLECULAR (fonte: http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/apostilacurso_molecular.pdf) | + | [OUTROS TAMPÕES E SOLUÇÕES - BIOLOGIA MOLECULAR (fonte: http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/apostilacurso_molecular.pdf)] |
| − | 1.PREPARO DE SOLUÇÕES
| + | |
| − | Soluções para extração de DNA
| + | |
| − | Solução estoque de Tris-HCl 1M
| + | |
| − | A solução foi preparada dissolvendo-se 121,10g de Trizma base (Tris
| + | |
| − | [hidroximetil] amino metano) (Sigma: T-1503) em aproximadamente 800mL de
| + | |
| − | água bidestilada (Milli-Q). O pH foi ajustado para 8,0 ( ou 7,5, quando
| + | |
| − | necessário), com HCl concentrado (aproximadamente 40mL) e o volume final
| + | |
| − | completado para 1000mL com água bidestilada. A solução foi distribuída em
| + | |
| − | frascos (100mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados à
| + | |
| − | temperatura ambiente.
| + | |
| − | Solução estoque de NaCl 5M
| + | |
| − | A solução foi preparada dissolvendo-se 292,24g de NaCl em 1000mL de água
| + | |
| − | bidestilada (q.s.p.). A solução foi distribuída em frascos (100 mL por frasco), os
| + | |
| − | quais foram esterilizados e estocados à temperatura ambiente.
| + | |
| − | Solução estoque de EDTA 0,5 M (pH 7,5 ou 8,0)
| + | |
| − | A solução foi preparada dissolvendo-se 186,10g de EDTA (Sigma: E-5134) em
| + | |
| − | 800mL de água bidestilada, sendo a mesma titulada com NaOH sólido
| + | |
| − | (aproximadamente 20,00g) até atingir o pH desejado (7,5 ou 8,0). Após a
| + | |
| − | dissolução completa do EDTA, o volume foi completado para 1000mL com
| + | |
| − | água bidestilada. A solução foi distribuída em frascos (100mL por frasco), os
| + | |
| − | quais foram esterilizados e estocados à temperatura ambiente.
| + | |
| − | SDS 10% (detergente)
| + | |
| − | A solução foi preparada dissolvendo-se 10g de SDS em aproximadamente
| + | |
| − | 80mL de água bidestilada aquecida. Após a dissolução completa do SDS, a
| + | |
| − | solução foi resfriada e o volume completado para 100mL com água bidestilada.
| + | |
| − | 50
| + | |
| − | A solução foi estocada à temperatura ambiente, não sendo necessária a
| + | |
| − | esterilização. ( O SDS precipita ao ser colocado em refrigerador).
| + | |
| − | Fenol Saturado
| + | |
| − | Foram dissolvidos 50,00g de fenol cristalizado (Synth) embanho- maria a 65°C
| + | |
| − | durante 5 a 6 horas e adicionando um volume de tampão Tris HCl 0,5 M pH
| + | |
| − | 8,0. A solução foi submetida a agitação durante 30 minutos, a fim de equilibrar
| + | |
| − | o pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M
| + | |
| − | pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M
| + | |
| − | pH 8,0. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume final de tampão Tris HCl 0,1
| + | |
| − | M pH 8,0 e estocado em frasco escuro a 4°C.
| + | |
| − | 1- Remover o fenol do freezer. Esperar atingir a temperatura ambiente.
| + | |
| − | Derretê-lo (50g) em banho-maria (65°C) dentro de um béquer. Manter o
| + | |
| − | frasco com a tampa levemente fechada.
| + | |
| − | 2- Ao fenol liquefeito, adicionar o volume igual de Tris HCl 0,5 M pH 8,0.
| + | |
| − | Colocar em erlenmeyer.
| + | |
| − | 3- Agitar a solução em agitador magnetico por 30 minutos para equilibrar o pH.
| + | |
| − | Cobrir o frasco todo com papel aluminio para evitar a oxidação do fenol.
| + | |
| − | Após 30 minutos, desligar o agitador e transferir o fenol para uma proveta.
| + | |
| − | Quando as duas fases se separarem, aspirar a fase aquosa superior (Tris-HCl 0,5 M) e descartá-la.
| + | |
| − | 4- Repetir o procedimento com Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. Após a separação a fase
| + | |
| − | aquosa ficou em cima e a fenolica embaixo.
| + | |
| − | 5- Repetir o procedimento até a fase fenólica apresentar pH> que 7,8. Utilizar o
| + | |
| − | papel medidor de pH.
| + | |
| − | 6- Remover a fase aquosa final. Adicionar 1/10 volume de Tris-HCl 0,1 M pH
| + | |
| − | 8,0 e hidroxiquinolina a 0,1% do volume de fenol. Estocara 4°C em frasco
| + | |
| − | escuro.
| + | |
| − | TRIS HCl 0,5 M Ph 8,0- Diluiu-se a solução de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em água
| + | |
| − | bidestilada na proporção de 1:1.
| + | |
| − | 51
| + | |
| − | TRIS HCl 0,1 M pH 8,0- Diluiu-se a solução de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em água
| + | |
| − | bidestilada na proporção de 1:10.
| + | |
| − | CLOROFANE
| + | |
| − | Este foi obtido a partir da mistura de um volume de fenol a aproximadamente
| + | |
| − | um volume de clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1).
| + | |
| − | ETANOL 70%
| + | |
| − | Álcool Etílico....................................................342mL
| + | |
| − | Água destilada..................................................58mL
| + | |
| − | TAMPÃO TRIS-EDTA (TE)
| + | |
| − | TRIS-HCl 1M pH 7,5.........................................10mL
| + | |
| − | EDTA 0,5M pH 8,0............................................ 2mL
| + | |
| − | O volume foi completado para 1000 mL com água bidestilada e a solução
| + | |
| − | esterilizada.
| + | |
| − | RNase
| + | |
| − | A RNase pancreatica (RNase A) foi preparada na concentração de 10mg/mL,
| + | |
| − | em 10mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 15 mM de NaCl. A solução foi aquecida em
| + | |
| − | banho-maria a 98°C por 15 minutos e estocada a -20°C.
| + | |
| − | Tris-HCl 10mM=Tris-HCl 0,01M
| + | |
| − | Tris-HCl 1M⇒Tris-HCl 0,01 M
| + | |
| − | (diluir 100x) = 1mL de Tris-HCl 1 M + 99mL de água
| + | |
| − | bidestilada
| + | |
| − | NaCl 15 mM = NaCl 0,015 M
| + | |
| − | Na Cl 1M ⇒ 58,45g
| + | |
| − | NaCl 0,015 ⇒ 0,877g em 1000,00 mL
| + | |
| − | 0,00877g de NaCl em 10,00mL de Tris-HCl 0,01M
| + | |
| − | 52
| + | |
| − | ⇒0,01g de RNase em 1,0mL de solução Tris-HCl/NaCl
| + | |
| − | Soluções para eletroforese
| + | |
| − | Solução Estoque de brometo de Etídio- 10mg/mL
| + | |
| − | Foi dissolvido 1% (p/v) de brometo de etídio em água destilada, agitado
| + | |
| − | durante 1 hora e estocado à temperatura ambiente ou refrigerador em um
| + | |
| − | frasco âmbar. No momento do uso, 3µL desta solução foram adicionados à
| + | |
| − | 100mL de tampão TEB 1X.
| + | |
| − | Brometo de etídio: 1% = 1g em 100,00mL de água destilada= 0,01g/mL =
| + | |
| − | 10mg/mL
| + | |
| − | Em 1,0mL de água destilada, teremos 0,01g ou 10mg
| + | |
| − | de brometo de etídio
| + | |
| − | TAMPÃO TRIS-BORATO-EDTA (TBE) - 10X - Tampão de Corrida
| + | |
| − | Trisma base.....................................................108g
| + | |
| − | Ácido Bórico.................................................... 55g
| + | |
| − | EDTA 0,5 M (pH 8,0)...................................... 40mL
| + | |
| − | O volume foi acertado para 1000mL com água destilada, deionizada e filtrada
| + | |
| − | em filtro Milli-Q (água Milli-Q). o tampão foi autoclavado e mantido a 4°C. No
| + | |
| − | momento do uso, o mesmo foi diluído com água Milli-Q para a obtenção da
| + | |
| − | concentração desejada.(0,5X ou 1,0X).
| + | |
| − | TEB 1X⇒Diluir o tampão TEB 10X na proporção de 1:10 em água Milli-Q.
| + | |
| − | 1volume de tampão TEB 10X : 9 volumes de água Milli-Q.
| + | |
| − | 100mL de tampão TEB 10X : 900mL de água Milli-Q.
| + | |
| − | 200mL de tampão TEB 10X : 1800mL de água Milli-Q.
| + | |
| − | 53
| + | |
| − | TAMPÃO DE AMOSTRA
| + | |
| − | Este tampão foi preparado a partir de uma solução de glicerol 30% em água
| + | |
| − | destilada, à qual adicionou-se azul de bromofenol (0,25%), sendo a solução
| + | |
| − | final estocada sob refrigeração.
| + | |
| − | No momento de uso, um volume deste tampão ( equivalente a 10%do volume
| + | |
| − | da amostra a ser aplicada no gel de agarose) é colocado sobre papel parafilm,
| + | |
| − | e a esse adicionado o volume correspondente a amostra. Ambos são
| + | |
| − | homogeneizados e aplicados na canaleta do gel de agarose com uma
| + | |
| − | micropipeta.
| + | |
| − | Exemplo: amostra a ser aplicada no gel de agarose - 20,0µL
| + | |
| − | tampão de amostra - 2,0µL
| + | |
| − | GEL DE AGAROSE 0,8% (para verificar a integridade do DNA)
| + | |
| − | Agarose (Sigma A-0169/Pharmacia/GIBCO)........................0,8g
| + | |
| − | TEB 1X.............................................................................100mL
| + | |
| − | Pesar a agarose em um Erlenmeyer e diluí-la em tampão TEB 1X. Ferver no
| + | |
| − | microondas durante aproximadamente 3 minutos (ou mais)na potência média,
| + | |
| − | pausando a cada 30 segundos, agitando levemente o frasco, a fim de
| + | |
| − | homogeneizar a agarose.
| + | |
| − | OBS: Medir o peso antes e após a fervura. Corrigir o peso, completando com
| + | |
| − | água Milli-Q.
| + | |
| − | OBS: A agarose dissolvida (após a fervura) deve ser resfriada até 50-60°C, e a
| + | |
| − | seguir, vertida sobre a placa de eletroforese. Deixar a agarose se polimerizar à
| + | |
| − | temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
| + | |
| − | 54
| + | |
| − | Soluções para hibridização
| + | |
| − | 1- Tampão de Desnaturação(0,5 N NaOH; 1,5 M NaCl), para 1 Litro:
| + | |
| − | • 20,0 g NaOH
| + | |
| − | • 87,66 g NaCl
| + | |
| − | • Dissolver em 800 mL de H2
| + | |
| − | O MilliQ e completar o volume p/ 1 Litro.
| + | |
| − | 2- Tampão de Neutralização(1 M Tris-Cl; 1,5 M NaCl), para 1 Litro:
| + | |
| − | • 121,14 g Tris-Cl, pH 7,5 (Tris-base)
| + | |
| − | • 87,66 g NaCl
| + | |
| − | • Dissolver em 800 mL de H2
| + | |
| − | O MilliQ, ajustar pH 7,5 com HCl e completar
| + | |
| − | o volume para 1 Litro.
| + | |
| − | 3- 20X SSC(3 M NaCl; 0,3 M Citrato de sódio), para 1 Litro:
| + | |
| − | • 175,3 g NaCl
| + | |
| − | • 88,2 g Citrato de Sódio
| + | |
| − | • Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 7,0 com HCl, completar o
| + | |
| − | volume para 1 Litro e autoclavar.
| + | |
| − | 4- Washing Buffer I(10% de Blocking Solution), p/ 1 Litro:
| + | |
| − | • 100 mL Blocking Solution
| + | |
| − | • 900 mL de H2O MilliQ
| + | |
| − | 5- 10X Washing Buffer II(100 mM Tris-Cl; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl
| + | |
| − | 2
| + | |
| − | ),
| + | |
| − | p/ 1 Litro:
| + | |
| − | • 12,1 g Tris-Cl (Tris base)
| + | |
| − | 55
| + | |
| − | • 5,8 g NaCl
| + | |
| − | • 2,0 g MgCl2
| + | |
| − | • Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 9,5 com HCl, completar o
| + | |
| − | volume para 1 Litro.
| + | |
| − | • Estocar 4° C.
| + | |
| − | 6- Blocking Solution(5% SDS; Phosphate, pH 7,2{17 mM Na
| + | |
| − | 2HPO4, 8
| + | |
| − | mM NaH2PO4
| + | |
| − | };125 mM NaCl), para 1 Litro:
| + | |
| − | • 7,3 g NaCl
| + | |
| − | • 2,4 g Na2HPO4
| + | |
| − | (dibásico)
| + | |
| − | • 1,0 g NaH2PO4
| + | |
| − | ( monobásico)
| + | |
| − | • 50 g SDS
| + | |
| − | • Dissolver em 800 mL de H2
| + | |
| − | O e ajustar o volume para 1 Litro.
| + | |
| − | 7 -0,1 X SSC, 0,1 % SDS, p/ 1 Litro:
| + | |
| − | • 10 ml SDS 10 %
| + | |
| − | • 5 ml 20 X SSC
| + | |
| − | • Completar para 1 Litro com H2
| + | |
| − | O MilliQ.
| + | |
| − | 8-2 X SSC, 0,1% SDS, p/ 1 Litro:
| + | |
| − | • 100 ml 20 X SSC
| + | |
| − | • 10 ml SDS 10 %
| + | |
| − | • Completar para 1 Litro com H2
| + | |
| − | O MilliQ.
| + | |
| − | 9-0,4 N NaOH, 0,1% SDS, p/ 1 Litro:
| + | |
| − | • 16 g NaOH
| + | |
| − | • 1 g SDS (ou 10 mL da solução SDS 10%)
| + | |
| − | • Completar o volume para 1 Litro com H2
| + | |
| − | O MilliQ.
| + | |
| − | 56
| + | |
| − | 10-0,2 M Tris-HCl, 0,1X SSC, p/ 1 litro:
| + | |
| − | • 200 mL Tris-HCl, pH 7,5 (tris base)
| + | |
| − | • 5 mL 20X SSC
| + | |
| − | • Completar o volume para 1 Litro com H2
| + | |
| − | O MilliQ.
| + | |
| − | 11-4 M LiCl(Cloreto de lítio), p/ 100 mL:
| + | |
| − | • 17 g Cloreto de lítio
| + | |
| − | • Dissolver em 80 mL de H2
| + | |
| − | O MilliQ, completar o volume p/ 100 mL.
| + | |
| − | • Autoclavar e guardar na geladeira (4° C).
| + | |
