DGGE - Passo a passo

Procedimentos

Montagem do Sistema

Limpar as placas de vidro utilizadas na montagem do gel (uma maior e outra menor) com álcool 100%. É recomendável que as placas não sejam limpas utilizando detergente na sua lavagem (somente água e esponja macia). Colocar entre as placas os espaçadores laterais de maneira que eles fiquem alinhados nas margens das placas e encaixar as placas nos sulcos dos grampos direito e esquerdo com as flechas apontando para cima e em direção as placas de vidro segurando firmemente. Em seguida, apoiar na superfície da bancada o sistema e ajustar os parafusos superiores dos grampos uniformemente até manter as placas fixas. Afrouxar um pouco os parafusos superiores, colocar o espaçador na parte superior para verificada a pressão ideal entre as duas placas e acochar os parafusos até a pressão máxima sem forçar. Utiliza-se um molde do gel em cartão para verificar se a pressão foi ideal entre as duas placas. É importante sempre manter alinhadas as placas para evitar vazamentos nas próximas etapas.

Após montado o “sanduíche” com as placas, ele deve ser colocado no suporte branco com a placa menor para frente. Pressionar o sistema contra a borracha vedante inferior encaixando e girando as presilhas desse suporte para baixo. Adicionar água Milli-Q no sistema, verificar a ocorrência de vazamento, descartar a água invertendo com cuidado o sistema na pia e secar o espaço entre as placas utilizando papel de filtro.

Confecção do Gel

Colocar as soluções desnaturantes a 37°C para dissolver os cristais da solução 100% formados pela estocagem a 4°C. Cada uma das soluções que constituirá o gel é colocada em um Tubo Falcon. Em um recipiente com gelo colocar os tubos Falcon “low” e “high”, que representam as soluções de menor e maior porcentagem de desnaturação do gradiente que deseja ser formado. Aliquotar as soluções 0% e 100% desnaturante de acordo com a tabela de gradiente de desnaturação de gel. Em seguida, adicionar 150 uL da solução de persulfato de amônio 10% e 14 uL de TEMED em cada tubo. Os tubos devem ser agitados invertendo-os várias vezes.

Após tem-se 8 min para realizar todo o processo de confecção do gel antes que a poliacrilamida polimerize. Usando-se as seringas nomeadas “low” e “high” sugar com a mangueira as soluções dos respectivos tubos para dentro da seringa, de modo que não se formem bolhas. As seringas devem está totalmente limpas. Acoplar as seringas ao aparelho que formará o gradiente desnaturante ao longo do gel, acochar os parafusos do sistema, acoplar os tubos das seringas a conexão “Y”, posicionar a ponteira por onde irá sair o gel entre as placas e girar a roda no sentido anti-horário lentamente de forma continua para formar o gradiente no gel. Posicionar o pente para formação dos poços e esperar 1h para completa polimerização do gel. Após aplicar as soluções no sistema lavar as seringas e todas as conexões para evitar entupimento e colocar para secar.

OBS: A acrilamida é uma sustância neurotóxica. Evitar o contato com a pele e usar sempre luvas.

Tampão de Corrida

Aliquotar 140 mL do tampão TAE 50X e completar com água para 7L. Transferir o tampão TAE 1X para o tanque do sistema do DCode e ligar o equipamento para aquecer. Configurar a temperatura para 70°C apesar da corrida ser a 60°C, devido ao fato de no momento da aplicação das amostras o tampão esfriar.

Montagem da Cuba de Tampão Superior

Após a polimerização do gel no sistema sanduíche, soltar o sistema do suporte branco e retirar os pentes da parte superior do gel.

Com a placa de vidro menor direcionada para o “core” posicionar o sanduíche de gel de forma que os pinos localizados lateralmente no “core” se encaixem nos sulcos das faces externas do sanduíche. Com os dedos segurar o “core” e os polegares apoiar a parte inferior dos grampos do sanduíche, empurrar o sanduíche de gel para baixo em direção ao “core”. Um “click” deve ser ouvido. Virar o “core” do outro lado e repetir o procedimento para acoplar o segundo sanduíche.

Checar o contato entre a borracha branca e a placa menor interna a fim de confirmar o posicionamento correto da placa formando um tanque. A instalação inapropriada do sanduíche de gel pode resultar em vazamento de tampão durante a corrida. Adicionar 350 mL de tampão de corrida na cuba de tampão superior e checar a vedação da cuba superior. Se o tampão estiver vazando despejar o tampão em um Becker, remover os sanduíches de gel e remontar o sistema.

Tanque de Eletroforese

Desligar o sistema Dcode, remover e colocar o módulo controlador de temperatura no suporte preto de metal. Colocar o “core” com os sanduíches dentro do tanque de eletroforese posicionando o botão vermelho sempre do lado direito e o botão preto do lado esquerdo do sistema. Adicionar 350 mL de tampão no tanque superior.

Aplicação das Amostras

Antes de aplicar as amostras utilizando-se uma pipeta deve-se dispensar tampão dentro dos poços para lavar e retirar os resíduos de poliacrilamida.

Preparar as amostras misturando-se em um microtubo o produto de PCR e o tampão de amostra na proporção 5:1 e aplicar em seus respectivos poços. Colocar o módulo controlador de temperatura sobre o tanque de eletroforese, ligar o aparelho (força, bomba e aquecedor), configurar a temperatura para 60°C, esperar atingir a temperatura e conectar o equipamento a fonte de eletroforese com a voltagem desejada (200V/3,5h).

Remoção do Gel

Ao término da corrida, desligar o aparelho, remover o módulo controlador de temperatura, deixar o sistema esfriar por 1 min no tampão e colocá-lo no suporte preto.

Remover o “core” dispensando o excesso de tampão dentro do tanque de eletroforese e colocá-lo na bancada deitado. Remover o sanduíche de gel com os dedos indicadores empurrando a parte inferior dos grampos para cima e com os polegares pressionando as alças pretas do “core” para baixo, até desencaixá-lo. Puxar o sanduíche de placas gentilmente para cima de maneira oposta àquela que ele foi encaixado ao “core”. Afrouxar os parafusos de cada grampo e remover os grampos do sanduíche. Retirar os espaçadores e descolar cuidadosamente as placas de vidro. Retirar os géis dentro de uma bandeja “lavando-os” com água para que desgrudem das placas e, assim, evitar que rasguem. Proceder com a coloração desejada.

Soluções

Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)

Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)

Reagentes	Quantidade
Acrilamida	38,93 g
Bis-Acrilamida	1,07 g
Água Milli-Q	qsp. 100 mL

• Filtrar a solução utilizando membrana de 0,45 µm e estocar a 4°C.

Tampão TAE - 50X

Tampão TAE - 50X

Reagente	Quantidade	Concentração Final
Tris Base	242 g	2 M
Ácido Acético Glacial	57,1 mL	1M
EDTA 0,5 M pH 8,0	100 mL	50 mM
Água Milli-Q	Qsp. 1000 mL

• Misturar e autoclavar por 20 min a 110°C. Estocar a temperatura ambiente.

Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento

Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento

Porcentagem do Gel	Tamanho do fragmento
6%	300-1000 pb
8%	200-400 pb
10%	100-300 pb

Solução Desnaturante 0%

Solução Desnaturante 0%

Reagentes	6%	8%	10%	12%
Acrilamida/Bis 40%	15ml	20ml	25	30ml
Tampão TAE 50X	2ml	2mm	2ml	2ml
Água Milli-Q	83ml	78ml	73ml	68ml
Volume total	100ml	100ml	100ml	100ml

• Misturar os componentes e filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Estocar a 4°C em garrafa escura por no máximo 1 mês.

Solução Desnaturante 100%

Solução Desnaturante 100%

Reagentes	6%	8%	10%	12%
Acrilamida/Bis 40%	15ml	20ml	25	30ml
Tampão TAE 50X	2ml	2mm	2ml	2ml
Água Milli-Q	40ml	40ml	40ml	40ml
Uréia	42g	42g	42g	42g
Água Milli-Q	qsp. 100ml	qsp. 100ml	qsp. 100ml	qsp. 100ml

Preparo da Solução Desnaturante 100% para gel 8% de Acrilamida/Bis

1. Adicionar 20 mL da solução estoque de Acrilamida/Bis e 5 mL de água Milli-Q em garrafa Schott.
2. Colocar a garrafa em banho-maria sob agitação a 37 °C e acrescentar aos poucos a uréia até dissolvê-la completamente.
3. Adicionar 2 mL do tampão TAE 50 X.
4. Por último, acrescentar 40 mL de formamida deionizada.
5. Conferir o volume e completar para 100 mL com água Milli-Q, caso seja necessário.
6. Deixar 10 min em repouso para desgaseificação e filtrar em membrana 0,45 µm.
7. Estocar a 4°C em garrafa escuro por no máximo 1 mês.

Solução de Persulfato de Amônio 10%

Solução de Persulfato de Amônio 10%

Reagente	Quantidade
Persulfato de amônio	0,1g
Água Milli-Q	1,0ml

• Estocar no escuro a -20ºC por uma semana

Tampão de amostra 2X

Tampão de amostra 2X

Reagente	Quantidade	Concentração final
Azul de bromofenol 2%	0,25ml	0,05%
Xileno Cianol 2%	0,25ml	0,05%
Glicerol 100%	70%
Água Milli-Q	2,5ml
Volume total	10ml

• Estocar a temperatura ambiente

Tampão de Corrida TAE 1X

Tampão de Corrida TAE 1X

Reagente	Quantidade
Tampão TAE 50X	140 mL
Água destilada	6860 mL
Volume Total	7000ml

Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE

Tabela de Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE

Conc. de Desnaturação	Solução 0 % Desnaturante	Solução 100 % Desnaturante
25%	12,0 mL	4,0 mL
30%	11,2 mL	4,8 mL
35%	10,4 mL	5,6 mL
40%	9,6 mL	6,4 mL
45%	8,8 mL	7,2 mL
50%	8,0 mL	8,0 mL
60%	6,4 mL	9,6 mL
65%	5,6 mL	10,4 mL
70%	4,8 mL	11,2 mL
75%	4,0 mL	12,0 mL

• Cálculos realizados para um volume de 16 mL por seringa (gel 16 X16 cm com 1 mm de espessura).

Protocolos

Protocolo PCR (rRNA 16S Bacteria)

PCR (rRNA 16S Bacteria)

Concentração final	1 reação (µL)
PCR Buffer (5X)	5
MgCl2 (25mM)	2
dNTPs (10 mM)	0,5
Primer 27F (5 µM)	2,5
Primer 1525R (5 µM)	2,5
GoTaq (5U/µL)	0,2
Total mix por reação	12,7
DNA (10 ng) mais água	12,3
Total	25 µL

Programa Bacteria

94°C	5 min
94°C	1 min	24X
51°C	1min	24X
72°C	3 min	24X
72°C	10 min
4°C

Protocolo PCR (rRNA 16S Achaea)

PCR (rRNA 16S Achaea)

Concentração final	1 reação (µL)
PCR Buffer (5X)	5
MgCl2 (25mM)	2
dNTPs (10 mM)	0,5
Primer 20F (5 µM)	1,5
Primer 958R (5 µM)	1,5
GoTaq (5U/µL)	0,2
Gelatina 1%	0,025
Total mix por reação	10,7
DNA (10 ng) mais água	14,3
Total	25 µL

Programa Archaea

94°C	5 min
94°C	0,5 min	30X
55°C	1min	30X
72°C	1 min	30X
72°C	10 min
4°C

Protocolo PCR de colônia

PCR de colônia

PCR Buffer (5X)	5
MgCl2 (25mM)	2
dNTPs (10 mM)	0,5
Primer M13F (5 µM)	2,5
Primer M13R (5 µM)	2,5
GoTaq (5U/µL)	0,2
Gelatina 1%	0,025
Total mix por reação	12,7
Água mais colônia	12,3
Total	25ul

Programa colônia

94°C	10 min
94°C	1 min	24X
55°C	1min	24X
72°C	1 min	24X
72°C	10 min
4°C

• Pega colônia com palito e coloca na água, depois acrescenta o mix

Eletroforese fragmento 1500 pb

0,8-1% agarose em TBE 0,5X

Cubeta pequena: 25 mL

Syber Safe: 0,5 µL

100 V

Eletroforese para cortar da banda do gel

0,8-1% agarose em TBE 0,5X

Cubeta grande: 90 mL

Syber Safe: 1 µL

Aplicar o volume de duas reações de PCR por poço (50 µL + 4 µL tampão de amostra)

100V

Purificação de DNA da banda do gel

Dissolvendo a banda do gel

1. Após a eletroforese, excisar a banda do gel e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (pesa o tubo antes e depois para saber o peso do gel)
2. Adicionar 10 µL da solução Membrane Binding para cada 10 mg da banda do gel. Vortex e incubar a 50-65 °C até que dissolva completamente. (Max. 350 mg de gel ou 40 µg DNA/membrana).

Ligação do DNA

1. Inserir minicoluna SV dentro de tudo coletor.
2. Transferir mistura de gel dissolvida. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
3. Centrifugar a 16000 x g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna no tubo coletor.

Lavagem

1. Adicionar 700 µL da Solução Membrane Wash (adicionado de etanol). Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna dentro do tubo coletor.
2. Repetir o passo 4 com 500 µL de solução Membrane Wash. Centrifugar a 16000 g por 5 min (13400 rpm por 8 min).
3. Esvaziar o tubo de coleta e recentrifugar a minicoluna + tubo coletor por 1 min com a tampa aberta para permitir a evaporação do etanol residual.

Eluição

1. Cuidadosamente transferir a minicoluna para um tubo de microcentrifuga 1,5 mL.
2. Adicionar 50 µL (20 µL) de água livre de nuclease para minicoluna. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min).
3. Descartar a minicoluna e estocar o DNA a 4 °C ou a -20 °C.

Concentrar DNA

O volume final do DNA eluído será de 100 µL. O DNA deve ser concentrado pela adição de 4 µL de NaCl 5M e invertido 3-5 vezes para misturar. Posteriormente adicionar 200 µL de etanol frio 100% e inverte 3-5 vezes para misturar. Centrifugar a 10000 g por 5 min a temperatura ambiente. Decanta todo o liquido. Remover o tanol residual em um dessecador, speed vácuo ou secar ao ar. Ressuspender o DNA precipitado em água estéril ou tris 10 mM estéril.

Secar DNA em termomixer a 40°C por 3 hrs.

Reação de ligação

Calcular a quantidade de DNA na reação de ligação (3:1, 5:1, 8:1)

{ [qtde de vetor (ng) x tamanho do inserto (kb)]/tamanho do vetor (kb) } x { razão molar x [inserto/vetor]} = inserto (ng)

Protocolo de ligação

1. Centrifugar o vetor e o DNA controle para coletar do fundo do tubo
2. Usar tubos de 0,5 mL
3. Agitar em vortex o tampão de ligação 2X antes de cada uso
   1. Preparar alíquotas do tampão
4. Misturar a reação por pipetagem
5. Incubar a reação por 1 hora a temperatura ambiente (24 °C) ou por 16 hs a 4 °C.

Obs: Se usar o tampão de ligação 10X acrescenta no tubo de ligação apenas 1 µL desse tampão, podendo completar o volume final com água ou mais DNA.

Tabela

Reagente	Reação (µL)	Controle + (µL)	Controle background
Tampão de ligação 2X	5	5	5
Vetor p-Gem-Easy	1	1	1
Produto de PCR X	-	-
DNA controle	-	2	-
T4 DNA ligase (30U/ µL)	1	1	1
Água q.s.p.	10	10	10

Transformação usando pGEM-T Easy vetor

1. Remover tubos da E. coli (50 µL) mantidas a -80 °C e colocar em um banho de gelo até descongelar (aproximadamente 5 min). Misturar as células batendo gentilmente no tubo.
2. Centrifugar os tubos contendo as reações de ligação para coletar o conteúdo do fundo do tubo. Adicionar 2 µL de cada reação de ligação para tubos contendo a E. coli. Gentilmente agite os tubos (devagar) para misturar a reação.

Protocolo de eletroporação

Antes de tudo, as cubetas devem estar previamente resfriadas (mantidas tb no gelo) até a eletroporação.

1. Transferir conteúdo preparado anteriormente para cubetas de eletroporação
2. De forma asséptica quando misturar as células e a ligação, coletar cuidadosamente e colocar no fundo da cubeta (4 e 2 mm)
3. Levar a cubeta ao eletroporador, ajustar a voltagem a 2500V e dar um pulso, vai aparecer a voltagem real que foi alcançada.
4. Dar outro pulso sem a cubeta para o eletroporador ficar pronto para uma nova amostra.
5. Após eletroporação, adicionar rapidamente à cubeta de eletroporação 900 µL do meio SOC previamente aquecido a 37 °C.
6. Pipetar gentilmente de 3-4x, com pipeta de 1 mL para ressuspensão das células, e transferir para tubo Falcon de 15 mL estéril
7. Deixar sob agitação a 150 rpm, 37 °C por 1,5 h.

Se usar uma cubeta de 1 mm usar voltagem de 1800V.

Protocolo de quimiotransformação

1. Coloque o tubo contendo a mistura de células e ligação em gelo por 20 minutos e depois aqueça apor 45-50 segundos em banho-maria a 42ºC (sem agitação) e retorne os tubos imediatamente ao gelo por 2 minutos.
2. Após a transformação, adicione 950 µl de meio SOC a temperatura ambiente aos tubos contendo as células transformadas.
3. Incube por 1,5 h a 37ºC a 150 rpm.

Protocolo de plaqueamento dos clones

1. Após a transformação plaquei 100 µl da cada cultura transformada em duplicata em placas com antibiótico. Se alto nº de colônias é requerido, as células podem ser centrifugadas 1000g/10min, ressuspendida em 200 µL de meio SOC e plaquei 100 µl em cada placa
2. Incube as placas overnight (16-24h) a 37ºC (± 100 colônias/placa)
3. Incubar as placas a 4ºC para facilitar a seleção de colônias azuis das brancas.

Meios de cultura

Meio SOB (100 mL)

• Triptona: 2 g
• Extrato de levedura: 0,5 g
• NaCl: 0,05 g

1. Adicionar parte da água e agitar até dissolver
2. Adicionar 1 mL de KCl 250 mM
3. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5N
4. Ajustar o volume para 100 mL
5. Autoclavar e quando esfriar adicionar 0,5 mL de MgCl2 2 M ou 1mL de MgCl2 1M.

Meio SOC (10 mL)

• Adicionar 180 µL de glicose 20% estéril

IPTG

0,5 mM (concentração final)

Estoque 0,1 M

1,2 g de IPTG em 50 mL de água milli-Q. Filtrar e estocar a 4 °C

Ampicilina

100 µg/mL (concentração final) - dissolvido em água milli-Q, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C

X-gal

80 µg/mL (concentração final) - dissolvido em dimetilformamida, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C.

Composição TBE (Tris-Borato-EDTA) 5X

54 g Tris

27,5 g de ácido bórico

3,72 g EDTA

Água q.s.p. 1L

pH 8,0

Composição TA (tampão de amostra) 6X

Azul de bromofenol 0,25% p/v

Glicerol 30%

TE

pH 8,0

Para 10 mL: 3 mL de glicerol e 0,025 g de azul de bromofenol. Completa com TE até o volume de 10 mL.

Composição TE (Tris-EDTA)

Tris 10 mM

EDTA 1 mM

pH 7,8 - 8,0

Para 100 mL: 0,121 g Tris (MM: 121,1) e 0,0326 g de EDTA (MM: 326). Adiciona água milli-Q até completar o volume para :100 mL.

Preparo de marcador 1Kb DNA ladder (1 mL)

75 µL de DNA padrão

501 µL de tampão TA 6X

12 µL de NaCl 5 M

412 µL de água milli-Q

Misturar tudo e aliquotar.

Observações e FAQ

A bóia possui posição específica: o anel interno deve ficar para baixo; caso conntrário o equipamento não funcionará