Preparo de células competentes - Eletroporação

IMPORTANTE

• A preparação deve ser feita com células frescas (com antibiótico -observar a resistência cromossomal da estirpe utilizada), em meio sólido LB ou 2xYT)
• TOP10F’ tem resistência cromossomal a estreptomicina (30 µg/mL)

Trabalhar em fluxo laminar estéril – não utilizar bico de Bunsen

Preparo das células

1. Inocular uma colônia isolada em 10 mL de meio líquido 2xTY contendo o antibiótico adequado. Incubar a 250 rpm, 37 °C, O/N.
2. Transferir 1,0 mL da cultura O/N para 100 mL de 2xTY + antibiótico, num erlenmeyer de 1000 mL. Incubar a 250 rpm, 37 °C, até OD600nm ~ 0,4 - 0,6 (não deixar passar de 0,600).
   • O inóculo deve ser de 1% do volume final de meio
   • Sempre utilizar 1% do volume de meio no erlenmeyer
3. Deixar erlenmeyer no gelo por 30 min
4. Centrifugar a 15.000 g, 15 min, 4 °C, em tubos estéreis gelados. Descartar o sobrenadante. Manter pellet no gelo
5. Lavar o pellet com 100 mL de glicerol 10% gelado
   • Ressuspender as células através de pancadas ritmadas aplicadas sobre o pellet com a palma da mão
   • IMPORTANTE: executar esse passo alternando os frascos, procurando mantê-los fora do gelo pelo menor tempo possível. Observar a ressuspensão completa (ausência de grumos)
   • Imediatamente após a ressuspensão, centrifugar como no passo 4
   • Repetir a lavagem com a metade do volume (a ressuspensão é mais fácil)
   • Transferir todo o volume para um único frasco (despejar) e centrifugar como no passo 4
6. Ressuspender o pellet resultante gentilmente, com auxílio de pepitador regulável em GYT gelado
   • O volume de ressuspensão dependerá do tamanho do pellet obtido. Sugestão: 300 – 500 µL
7. Transferir a ressuspensão para eppendorfs estéreis mantidos no gelo
8. Transferir alíquotas de 50 µL para eppendorfs estéreis gelados e imediatamente congelar em gelo seco (sem acetona). Jamais utilizar nitrogênio líquido
9. Armazenar a –80 °C

Eletroporação

Preparação

DNA

Mantido no gelo até o momento de usar

CUBETAS

Devem ser previamente geladas (mantidas no freezer) e mantidas mergulhadas no gelo até o uso

SUPORTE DE CUBETA

Mantido em gelo

Meio SOC

Pré-aquecer a 37 °C

Para cubetas de 2 µm

40 - 50 µL de célula competente

volume desejado de DNA (2,0 a 10 μL)

Condições de eletroporação

Eletroporador: Eppendorf – Eletroporator Modelo 2510

2500 V

Procedimento

1. Após eletroporação, adicionar rapidamente à cubeta de eletroporação 1,0 mL do meio SOC previamente aquecido a 37 °C.
2. Pipetar gentilmente de 3 – 4x, com pipetador de 1 mL para ressuspensão e transferir para tubo tipo Falcon de 15 mL estéril
3. Deixar sob agitação em Shaker (100 rpm, 37 °C, 30-40 min)
4. Plaquear em placas de Petri contendo o meio e o antibiótico adequados
   • 50 – 100 µL para placas de 9 cm de diâmetro, com auxílio de alça
   • 500 µL para placas de 20 x 20 cm, com auxílio de esferas de vidro estéreis

Soluções

MEIO 2xYT

Triptona 1,6%

Extaro de levedura 1,0%

NaCl 0,5%

Autoclavar 121 °C, 15 min

GYT

Glicerol 10%

Extrato de levedura 0,125%

Triptona 0,25%

Autoclavar 121 °C, 15 min

MEIO SOC

Meio SOB – para 1 mL

Glicose 20% - 40 µL (esterilizada por filtração)

Cloreto de magnésio estéril 1 M – 40 µL

MEIO SOB

Triptona – 2%

Extrato de levedura 0,5%

Cloreto de sódio 0,058%

Cloreto de potássio 0,02%

Ajustar pH 7,5 com KOH 5N

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