Preparo de plasmídeos - Microplacas

CUIDADOS ESPECIAIS

Observar atentamente a orientação das placas.

Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes.

Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência.

PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS (96-well) Crescimento

Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)

1. Encher cada poço de um bloco de crescimento de 96 poços com 1,0 mL de meio Circle Grow contendo o antibiótico adequado, se necessário.
   • 250 mL de meio é suficiente para duas placas
2. Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo

Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 uL de estoque para 1 mL de meio)

1. Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA)
2. Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC

Marcar a placa com fita crepe contendo

Nome do responsável

Nº da placa

Biblioteca.

Selar a placa com adesivo

MINI-PREP EM MICROPLACAS

1. Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado
   • 1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro
   • Fixar com fita adesiva, uma placa Millipore (MAGV N22) no topo de uma microplaca de fundo em “V” de 250 µL de polipropileno. Verificar se os poços estão alinhados.
2. Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA
3. Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
4. Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
5. Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células.
6. Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min.
7. Adicionar a cada poço 80 µL de GET já contendo RNAse (preparar 20 mL de GET + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
8. Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
9. Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de GET + células para uma placa de fundo U
10. Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1%
    • Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser estocada
    • 1 mL NaOH 4M + 2 mL SDS 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas).
    • Não pode ser adicionada uma solução de NaOH após SDS 10%, use água como intermediário.
11. Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
    • Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.
12. Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo.
13. Adicionar a cada poço 80 µL de acetato de potássio 3M (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão
14. Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm.
15. Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo
16. Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min.
17. Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC
18. Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”).
    • Caso centrifugada por muito mais de 5 min a 4000rpm a placa Millipore corre o risco de rachar.
19. Remover e descartar a placa Millipore. Adicionar 100 µL de Isopropanol ao filtrado (que está na microplaca de fundo V)
20. Selar bem a placa com novo adesivo (resistente a álcool) e misturar 30 vezes por inversão.
21. Centrifugar por 45 min, 4000 rpm, 20ºC.
22. Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante (invertendo a placa)
23. Adicione 200 µL de Etanol 70% gelado.
24. Centrifugar por 5 min, 4000 rpm a 20ºC. Remova o sobrenadante.
25. Inverter a placa sobre papel absorvente e pulsar, 600 rpm, 20ºC.
26. Deixar a placa secar em TA por 60 min, coberta com papel toalha.
27. Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’.
28. Guardar placa no freezer – 20oC.

SOLUÇÕES

GET

Glicose 50 mM filtrada

EDTA 10mM pH 8,0

Tris-HCl 25 mM pH 7,4

Para 500 mL

10 mL de EDTA 0,5M + 12,5 mL de Tris-HCl 1M + 22,5 mL glicose 20% + H2O q.s.p. 500 mL;

Autoclavar 121 °C; 15 min

SDS - NaOH

SDS 10% - 300 uL

NaOH 4M – 150 uL

H2O q.s.p. 3 mL

Acetato de potássio 3M (KOAc)

Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g)

Ácido acético glacial – 11,5 mL

H2O Milli-Q autoclavada q.s.p. 100 mL

Filtrar em papel de filtro com funil;

Armazenar a solução em frasco de plástico

Para preparar a solução estoque de Acetato de Potassio 5 M

246,87 g de KOAc em H2O q.s.p. para 500 mL.

Filtrar em papel de filtro