DGGE - Passo a passo
(→Protocolos) |
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(5 edições intermediárias de um usuário não apresentadas) | |||
Linha 193: | Linha 193: | ||
==Protocolos== | ==Protocolos== | ||
− | {|width="500px" | + | ===Protocolo PCR (rRNA 16S Bacteria)=== |
− | |+ | + | {|width="500px" align="center" |
+ | |+PCR (rRNA 16S Bacteria) | ||
|Concentração final||1 reação (µL) | |Concentração final||1 reação (µL) | ||
|- | |- | ||
Linha 215: | Linha 216: | ||
|Total||25 µL | |Total||25 µL | ||
|} | |} | ||
− | {|width="500px" | + | {|width="500px" align="center" |
|+Programa Bacteria | |+Programa Bacteria | ||
|94°C||5 min | |94°C||5 min | ||
Linha 230: | Linha 231: | ||
|} | |} | ||
− | + | ===Protocolo PCR (rRNA 16S Achaea)=== | |
{|width="500px" align="center" | {|width="500px" align="center" | ||
− | |+ | + | |+PCR (rRNA 16S Achaea) |
|Concentração final||1 reação (µL) | |Concentração final||1 reação (µL) | ||
|- | |- | ||
Linha 269: | Linha 270: | ||
|4°C|| | |4°C|| | ||
|} | |} | ||
+ | |||
+ | ===Protocolo PCR de colônia=== | ||
+ | {|width="500px" align="center" | ||
+ | |+PCR de colônia | ||
+ | |PCR Buffer (5X)||5 | ||
+ | |- | ||
+ | |MgCl2 (25mM)||2 | ||
+ | |- | ||
+ | |dNTPs (10 mM)||0,5 | ||
+ | |- | ||
+ | |Primer M13F (5 µM)||2,5 | ||
+ | |- | ||
+ | |Primer M13R (5 µM)||2,5 | ||
+ | |- | ||
+ | |GoTaq (5U/µL)||0,2 | ||
+ | |- | ||
+ | |Gelatina 1%||0,025 | ||
+ | |- | ||
+ | |Total mix por reação||12,7 | ||
+ | |- | ||
+ | |Água mais colônia||12,3 | ||
+ | |- | ||
+ | |Total||25ul | ||
+ | |} | ||
+ | {|width="500px" align="center" | ||
+ | |+Programa colônia | ||
+ | |94°C||10 min | ||
+ | |- | ||
+ | |94°C||1 min||24X | ||
+ | |- | ||
+ | |55°C||1min||24X | ||
+ | |- | ||
+ | |72°C||1 min||24X | ||
+ | |- | ||
+ | |72°C||10 min | ||
+ | |- | ||
+ | |4°C | ||
+ | |} | ||
+ | *Pega colônia com palito e coloca na água, depois acrescenta o mix | ||
+ | |||
+ | ;Eletroforese fragmento 1500 pb | ||
+ | :0,8-1% agarose em TBE 0,5X | ||
+ | :Cubeta pequena: 25 mL | ||
+ | :Syber Safe: 0,5 µL | ||
+ | :100 V | ||
+ | |||
+ | ;Eletroforese para cortar da banda do gel | ||
+ | :0,8-1% agarose em TBE 0,5X | ||
+ | :Cubeta grande: 90 mL | ||
+ | :Syber Safe: 1 µL | ||
+ | :Aplicar o volume de duas reações de PCR por poço (50 µL + 4 µL tampão de amostra) | ||
+ | :100V | ||
+ | |||
+ | |||
+ | ===Purificação de DNA da banda do gel=== | ||
+ | ;Dissolvendo a banda do gel | ||
+ | #Após a eletroforese, excisar a banda do gel e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (pesa o tubo antes e depois para saber o peso do gel) | ||
+ | #Adicionar 10 µL da solução Membrane Binding para cada 10 mg da banda do gel. Vortex e incubar a 50-65 °C até que dissolva completamente. (Max. 350 mg de gel ou 40 µg DNA/membrana). | ||
+ | ;Ligação do DNA | ||
+ | #Inserir minicoluna SV dentro de tudo coletor. | ||
+ | #Transferir mistura de gel dissolvida. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. | ||
+ | #Centrifugar a 16000 x g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna no tubo coletor. | ||
+ | ;Lavagem | ||
+ | #Adicionar 700 µL da Solução Membrane Wash (adicionado de etanol). Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna dentro do tubo coletor. | ||
+ | #Repetir o passo 4 com 500 µL de solução Membrane Wash. Centrifugar a 16000 g por 5 min (13400 rpm por 8 min). | ||
+ | #Esvaziar o tubo de coleta e recentrifugar a minicoluna + tubo coletor por 1 min com a tampa aberta para permitir a evaporação do etanol residual. | ||
+ | ;Eluição | ||
+ | #Cuidadosamente transferir a minicoluna para um tubo de microcentrifuga 1,5 mL. | ||
+ | #Adicionar 50 µL (20 µL) de água livre de nuclease para minicoluna. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min). | ||
+ | #Descartar a minicoluna e estocar o DNA a 4 °C ou a -20 °C. | ||
+ | |||
+ | ===Concentrar DNA=== | ||
+ | O volume final do DNA eluído será de 100 µL. O DNA deve ser concentrado pela adição de 4 µL de NaCl 5M e invertido 3-5 vezes para misturar. Posteriormente adicionar 200 µL de etanol frio 100% e inverte 3-5 vezes para misturar. Centrifugar a 10000 g por 5 min a temperatura ambiente. Decanta todo o liquido. Remover o tanol residual em um dessecador, speed vácuo ou secar ao ar. Ressuspender o DNA precipitado em água estéril ou tris 10 mM estéril. | ||
+ | |||
+ | Secar DNA em termomixer a 40°C por 3 hrs. | ||
+ | |||
+ | ===Reação de ligação=== | ||
+ | |||
+ | Calcular a quantidade de DNA na reação de ligação (3:1, 5:1, 8:1) | ||
+ | |||
+ | { [qtde de vetor (ng) x tamanho do inserto (kb)]/tamanho do vetor (kb) } x { razão molar x [inserto/vetor]} = inserto (ng) | ||
+ | |||
+ | ===Protocolo de ligação=== | ||
+ | #Centrifugar o vetor e o DNA controle para coletar do fundo do tubo | ||
+ | #Usar tubos de 0,5 mL | ||
+ | #Agitar em vortex o tampão de ligação 2X antes de cada uso | ||
+ | ##Preparar alíquotas do tampão | ||
+ | #Misturar a reação por pipetagem | ||
+ | #Incubar a reação por 1 hora a temperatura ambiente (24 °C) ou por 16 hs a 4 °C. | ||
+ | |||
+ | Obs: Se usar o tampão de ligação 10X acrescenta no tubo de ligação apenas 1 µL desse tampão, podendo completar o volume final com água ou mais DNA. | ||
+ | |||
+ | {|width="500px" align="center" | ||
+ | |+Tabela | ||
+ | |Reagente||Reação (µL)||Controle + (µL)||Controle background | ||
+ | |- | ||
+ | |Tampão de ligação 2X||5||5||5 | ||
+ | |- | ||
+ | |Vetor p-Gem-Easy||1||1||1 | ||
+ | |- | ||
+ | |Produto de PCR X||-||-|| | ||
+ | |- | ||
+ | |DNA controle||-||2||- | ||
+ | |- | ||
+ | |T4 DNA ligase (30U/ µL)||1||1||1 | ||
+ | |- | ||
+ | |Água q.s.p.||10||10||10 | ||
+ | |} | ||
+ | |||
+ | |||
+ | ===Transformação usando pGEM-T Easy vetor=== | ||
+ | #Remover tubos da E. coli (50 µL) mantidas a -80 °C e colocar em um banho de gelo até descongelar (aproximadamente 5 min). Misturar as células batendo gentilmente no tubo. | ||
+ | #Centrifugar os tubos contendo as reações de ligação para coletar o conteúdo do fundo do tubo. Adicionar 2 µL de cada reação de ligação para tubos contendo a E. coli. Gentilmente agite os tubos (devagar) para misturar a reação. | ||
+ | |||
+ | ===Protocolo de eletroporação=== | ||
+ | ;Antes de tudo, as cubetas devem estar previamente resfriadas (mantidas tb no gelo) até a eletroporação. | ||
+ | #Transferir conteúdo preparado anteriormente para cubetas de eletroporação | ||
+ | #De forma asséptica quando misturar as células e a ligação, coletar cuidadosamente e colocar no fundo da cubeta (4 e 2 mm) | ||
+ | #Levar a cubeta ao eletroporador, ajustar a voltagem a 2500V e dar um pulso, vai aparecer a voltagem real que foi alcançada. | ||
+ | #Dar outro pulso sem a cubeta para o eletroporador ficar pronto para uma nova amostra. | ||
+ | #Após eletroporação, adicionar rapidamente à cubeta de eletroporação 900 µL do meio SOC previamente aquecido a 37 °C. | ||
+ | #Pipetar gentilmente de 3-4x, com pipeta de 1 mL para ressuspensão das células, e transferir para tubo Falcon de 15 mL estéril | ||
+ | #Deixar sob agitação a 150 rpm, 37 °C por 1,5 h. | ||
+ | Se usar uma cubeta de 1 mm usar voltagem de 1800V. | ||
+ | |||
+ | ===Protocolo de quimiotransformação=== | ||
+ | |||
+ | #Coloque o tubo contendo a mistura de células e ligação em gelo por 20 minutos e depois aqueça apor 45-50 segundos em banho-maria a 42ºC (sem agitação) e retorne os tubos imediatamente ao gelo por 2 minutos. | ||
+ | #Após a transformação, adicione 950 µl de meio SOC a temperatura ambiente aos tubos contendo as células transformadas. | ||
+ | #Incube por 1,5 h a 37ºC a 150 rpm. | ||
+ | |||
+ | ===Protocolo de plaqueamento dos clones=== | ||
+ | |||
+ | #Após a transformação plaquei 100 µl da cada cultura transformada em duplicata em placas com antibiótico. Se alto nº de colônias é requerido, as células podem ser centrifugadas 1000g/10min, ressuspendida em 200 µL de meio SOC e plaquei 100 µl em cada placa | ||
+ | #Incube as placas overnight (16-24h) a 37ºC (± 100 colônias/placa) | ||
+ | #Incubar as placas a 4ºC para facilitar a seleção de colônias azuis das brancas. | ||
+ | |||
+ | ===Meios de cultura=== | ||
+ | ;Meio SOB (100 mL) | ||
+ | *Triptona: 2 g | ||
+ | *Extrato de levedura: 0,5 g | ||
+ | *NaCl: 0,05 g | ||
+ | #Adicionar parte da água e agitar até dissolver | ||
+ | #Adicionar 1 mL de KCl 250 mM | ||
+ | #Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5N | ||
+ | #Ajustar o volume para 100 mL | ||
+ | #Autoclavar e quando esfriar adicionar 0,5 mL de MgCl2 2 M ou 1mL de MgCl2 1M. | ||
+ | |||
+ | ;Meio SOC (10 mL) | ||
+ | *Adicionar 180 µL de glicose 20% estéril | ||
+ | |||
+ | ;IPTG: 0,5 mM (concentração final) | ||
+ | :;Estoque 0,1 M: | ||
+ | ::1,2 g de IPTG em 50 mL de água milli-Q. Filtrar e estocar a 4 °C | ||
+ | :;Ampicilina: | ||
+ | ::100 µg/mL (concentração final) - dissolvido em água milli-Q, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C | ||
+ | :;X-gal: | ||
+ | ::80 µg/mL (concentração final) - dissolvido em dimetilformamida, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C. | ||
+ | |||
+ | ;Composição TBE (Tris-Borato-EDTA) 5X | ||
+ | :54 g Tris | ||
+ | :27,5 g de ácido bórico | ||
+ | :3,72 g EDTA | ||
+ | :Água q.s.p. 1L | ||
+ | :pH 8,0 | ||
+ | |||
+ | ;Composição TA (tampão de amostra) 6X | ||
+ | :Azul de bromofenol 0,25% p/v | ||
+ | :Glicerol 30% | ||
+ | :TE | ||
+ | :pH 8,0 | ||
+ | :Para 10 mL: 3 mL de glicerol e 0,025 g de azul de bromofenol. Completa com TE até o volume de 10 mL. | ||
+ | |||
+ | ;Composição TE (Tris-EDTA) | ||
+ | :Tris 10 mM | ||
+ | :EDTA 1 mM | ||
+ | :pH 7,8 - 8,0 | ||
+ | :Para 100 mL: 0,121 g Tris (MM: 121,1) e 0,0326 g de EDTA (MM: 326). Adiciona água milli-Q até completar o volume para :100 mL. | ||
+ | |||
+ | ;Preparo de marcador 1Kb DNA ladder (1 mL) | ||
+ | :75 µL de DNA padrão | ||
+ | :501 µL de tampão TA 6X | ||
+ | :12 µL de NaCl 5 M | ||
+ | :412 µL de água milli-Q | ||
+ | :Misturar tudo e aliquotar. | ||
+ | |||
+ | ==Observações e FAQ== | ||
+ | A bóia possui posição específica: o anel interno deve ficar para baixo; caso conntrário o equipamento não funcionará |
Edição atual tal como 15h31min de 5 de setembro de 2011
[editar] Procedimentos
[editar] Montagem do Sistema
Limpar as placas de vidro utilizadas na montagem do gel (uma maior e outra menor) com álcool 100%. É recomendável que as placas não sejam limpas utilizando detergente na sua lavagem (somente água e esponja macia). Colocar entre as placas os espaçadores laterais de maneira que eles fiquem alinhados nas margens das placas e encaixar as placas nos sulcos dos grampos direito e esquerdo com as flechas apontando para cima e em direção as placas de vidro segurando firmemente. Em seguida, apoiar na superfície da bancada o sistema e ajustar os parafusos superiores dos grampos uniformemente até manter as placas fixas. Afrouxar um pouco os parafusos superiores, colocar o espaçador na parte superior para verificada a pressão ideal entre as duas placas e acochar os parafusos até a pressão máxima sem forçar. Utiliza-se um molde do gel em cartão para verificar se a pressão foi ideal entre as duas placas. É importante sempre manter alinhadas as placas para evitar vazamentos nas próximas etapas.
Após montado o “sanduíche” com as placas, ele deve ser colocado no suporte branco com a placa menor para frente. Pressionar o sistema contra a borracha vedante inferior encaixando e girando as presilhas desse suporte para baixo. Adicionar água Milli-Q no sistema, verificar a ocorrência de vazamento, descartar a água invertendo com cuidado o sistema na pia e secar o espaço entre as placas utilizando papel de filtro.
[editar] Confecção do Gel
Colocar as soluções desnaturantes a 37°C para dissolver os cristais da solução 100% formados pela estocagem a 4°C. Cada uma das soluções que constituirá o gel é colocada em um Tubo Falcon. Em um recipiente com gelo colocar os tubos Falcon “low” e “high”, que representam as soluções de menor e maior porcentagem de desnaturação do gradiente que deseja ser formado. Aliquotar as soluções 0% e 100% desnaturante de acordo com a tabela de gradiente de desnaturação de gel. Em seguida, adicionar 150 uL da solução de persulfato de amônio 10% e 14 uL de TEMED em cada tubo. Os tubos devem ser agitados invertendo-os várias vezes.
Após tem-se 8 min para realizar todo o processo de confecção do gel antes que a poliacrilamida polimerize. Usando-se as seringas nomeadas “low” e “high” sugar com a mangueira as soluções dos respectivos tubos para dentro da seringa, de modo que não se formem bolhas. As seringas devem está totalmente limpas. Acoplar as seringas ao aparelho que formará o gradiente desnaturante ao longo do gel, acochar os parafusos do sistema, acoplar os tubos das seringas a conexão “Y”, posicionar a ponteira por onde irá sair o gel entre as placas e girar a roda no sentido anti-horário lentamente de forma continua para formar o gradiente no gel. Posicionar o pente para formação dos poços e esperar 1h para completa polimerização do gel. Após aplicar as soluções no sistema lavar as seringas e todas as conexões para evitar entupimento e colocar para secar.
OBS: A acrilamida é uma sustância neurotóxica. Evitar o contato com a pele e usar sempre luvas.
[editar] Tampão de Corrida
Aliquotar 140 mL do tampão TAE 50X e completar com água para 7L. Transferir o tampão TAE 1X para o tanque do sistema do DCode e ligar o equipamento para aquecer. Configurar a temperatura para 70°C apesar da corrida ser a 60°C, devido ao fato de no momento da aplicação das amostras o tampão esfriar.
[editar] Montagem da Cuba de Tampão Superior
Após a polimerização do gel no sistema sanduíche, soltar o sistema do suporte branco e retirar os pentes da parte superior do gel.
Com a placa de vidro menor direcionada para o “core” posicionar o sanduíche de gel de forma que os pinos localizados lateralmente no “core” se encaixem nos sulcos das faces externas do sanduíche. Com os dedos segurar o “core” e os polegares apoiar a parte inferior dos grampos do sanduíche, empurrar o sanduíche de gel para baixo em direção ao “core”. Um “click” deve ser ouvido. Virar o “core” do outro lado e repetir o procedimento para acoplar o segundo sanduíche.
Checar o contato entre a borracha branca e a placa menor interna a fim de confirmar o posicionamento correto da placa formando um tanque. A instalação inapropriada do sanduíche de gel pode resultar em vazamento de tampão durante a corrida. Adicionar 350 mL de tampão de corrida na cuba de tampão superior e checar a vedação da cuba superior. Se o tampão estiver vazando despejar o tampão em um Becker, remover os sanduíches de gel e remontar o sistema.
[editar] Tanque de Eletroforese
Desligar o sistema Dcode, remover e colocar o módulo controlador de temperatura no suporte preto de metal. Colocar o “core” com os sanduíches dentro do tanque de eletroforese posicionando o botão vermelho sempre do lado direito e o botão preto do lado esquerdo do sistema. Adicionar 350 mL de tampão no tanque superior.
[editar] Aplicação das Amostras
Antes de aplicar as amostras utilizando-se uma pipeta deve-se dispensar tampão dentro dos poços para lavar e retirar os resíduos de poliacrilamida.
Preparar as amostras misturando-se em um microtubo o produto de PCR e o tampão de amostra na proporção 5:1 e aplicar em seus respectivos poços. Colocar o módulo controlador de temperatura sobre o tanque de eletroforese, ligar o aparelho (força, bomba e aquecedor), configurar a temperatura para 60°C, esperar atingir a temperatura e conectar o equipamento a fonte de eletroforese com a voltagem desejada (200V/3,5h).
[editar] Remoção do Gel
Ao término da corrida, desligar o aparelho, remover o módulo controlador de temperatura, deixar o sistema esfriar por 1 min no tampão e colocá-lo no suporte preto.
Remover o “core” dispensando o excesso de tampão dentro do tanque de eletroforese e colocá-lo na bancada deitado. Remover o sanduíche de gel com os dedos indicadores empurrando a parte inferior dos grampos para cima e com os polegares pressionando as alças pretas do “core” para baixo, até desencaixá-lo. Puxar o sanduíche de placas gentilmente para cima de maneira oposta àquela que ele foi encaixado ao “core”. Afrouxar os parafusos de cada grampo e remover os grampos do sanduíche. Retirar os espaçadores e descolar cuidadosamente as placas de vidro. Retirar os géis dentro de uma bandeja “lavando-os” com água para que desgrudem das placas e, assim, evitar que rasguem. Proceder com a coloração desejada.
[editar] Soluções
[editar] Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)
Reagentes | Quantidade |
Acrilamida | 38,93 g |
Bis-Acrilamida | 1,07 g |
Água Milli-Q | qsp. 100 mL |
- Filtrar a solução utilizando membrana de 0,45 µm e estocar a 4°C.
[editar] Tampão TAE - 50X
Reagente | Quantidade | Concentração Final |
Tris Base | 242 g | 2 M |
Ácido Acético Glacial | 57,1 mL | 1M |
EDTA 0,5 M pH 8,0 | 100 mL | 50 mM |
Água Milli-Q | Qsp. 1000 mL |
- Misturar e autoclavar por 20 min a 110°C. Estocar a temperatura ambiente.
[editar] Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento
Porcentagem do Gel | Tamanho do fragmento |
6% | 300-1000 pb |
8% | 200-400 pb |
10% | 100-300 pb |
[editar] Solução Desnaturante 0%
Reagentes | 6% | 8% | 10% | 12% |
Acrilamida/Bis 40% | 15ml | 20ml | 25 | 30ml |
Tampão TAE 50X | 2ml | 2mm | 2ml | 2ml |
Água Milli-Q | 83ml | 78ml | 73ml | 68ml |
Volume total | 100ml | 100ml | 100ml | 100ml |
- Misturar os componentes e filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Estocar a 4°C em garrafa escura por no máximo 1 mês.
[editar] Solução Desnaturante 100%
Reagentes | 6% | 8% | 10% | 12% |
Acrilamida/Bis 40% | 15ml | 20ml | 25 | 30ml |
Tampão TAE 50X | 2ml | 2mm | 2ml | 2ml |
Água Milli-Q | 40ml | 40ml | 40ml | 40ml |
Uréia | 42g | 42g | 42g | 42g |
Água Milli-Q | qsp. 100ml | qsp. 100ml | qsp. 100ml | qsp. 100ml |
- Preparo da Solução Desnaturante 100% para gel 8% de Acrilamida/Bis
- Adicionar 20 mL da solução estoque de Acrilamida/Bis e 5 mL de água Milli-Q em garrafa Schott.
- Colocar a garrafa em banho-maria sob agitação a 37 °C e acrescentar aos poucos a uréia até dissolvê-la completamente.
- Adicionar 2 mL do tampão TAE 50 X.
- Por último, acrescentar 40 mL de formamida deionizada.
- Conferir o volume e completar para 100 mL com água Milli-Q, caso seja necessário.
- Deixar 10 min em repouso para desgaseificação e filtrar em membrana 0,45 µm.
- Estocar a 4°C em garrafa escuro por no máximo 1 mês.
[editar] Solução de Persulfato de Amônio 10%
Reagente | Quantidade |
Persulfato de amônio | 0,1g |
Água Milli-Q | 1,0ml |
- Estocar no escuro a -20ºC por uma semana
[editar] Tampão de amostra 2X
Reagente | Quantidade | Concentração final |
Azul de bromofenol 2% | 0,25ml | 0,05% |
Xileno Cianol 2% | 0,25ml | 0,05% |
Glicerol 100% | 70% | |
Água Milli-Q | 2,5ml | |
Volume total | 10ml |
- Estocar a temperatura ambiente
[editar] Tampão de Corrida TAE 1X
Reagente | Quantidade |
Tampão TAE 50X | 140 mL |
Água destilada | 6860 mL |
Volume Total | 7000ml |
[editar] Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE
Conc. de Desnaturação | Solução 0 % Desnaturante | Solução 100 % Desnaturante |
25% | 12,0 mL | 4,0 mL |
30% | 11,2 mL | 4,8 mL |
35% | 10,4 mL | 5,6 mL |
40% | 9,6 mL | 6,4 mL |
45% | 8,8 mL | 7,2 mL |
50% | 8,0 mL | 8,0 mL |
60% | 6,4 mL | 9,6 mL |
65% | 5,6 mL | 10,4 mL |
70% | 4,8 mL | 11,2 mL |
75% | 4,0 mL | 12,0 mL |
- Cálculos realizados para um volume de 16 mL por seringa (gel 16 X16 cm com 1 mm de espessura).
[editar] Protocolos
[editar] Protocolo PCR (rRNA 16S Bacteria)
Concentração final | 1 reação (µL) |
PCR Buffer (5X) | 5 |
MgCl2 (25mM) | 2 |
dNTPs (10 mM) | 0,5 |
Primer 27F (5 µM) | 2,5 |
Primer 1525R (5 µM) | 2,5 |
GoTaq (5U/µL) | 0,2 |
Total mix por reação | 12,7 |
DNA (10 ng) mais água | 12,3 |
Total | 25 µL |
94°C | 5 min | |
94°C | 1 min | 24X |
51°C | 1min | 24X |
72°C | 3 min | 24X |
72°C | 10 min | |
4°C |
[editar] Protocolo PCR (rRNA 16S Achaea)
Concentração final | 1 reação (µL) |
PCR Buffer (5X) | 5 |
MgCl2 (25mM) | 2 |
dNTPs (10 mM) | 0,5 |
Primer 20F (5 µM) | 1,5 |
Primer 958R (5 µM) | 1,5 |
GoTaq (5U/µL) | 0,2 |
Gelatina 1% | 0,025 |
Total mix por reação | 10,7 |
DNA (10 ng) mais água | 14,3 |
Total | 25 µL |
94°C | 5 min | |
94°C | 0,5 min | 30X |
55°C | 1min | 30X |
72°C | 1 min | 30X |
72°C | 10 min | |
4°C |
[editar] Protocolo PCR de colônia
PCR Buffer (5X) | 5 |
MgCl2 (25mM) | 2 |
dNTPs (10 mM) | 0,5 |
Primer M13F (5 µM) | 2,5 |
Primer M13R (5 µM) | 2,5 |
GoTaq (5U/µL) | 0,2 |
Gelatina 1% | 0,025 |
Total mix por reação | 12,7 |
Água mais colônia | 12,3 |
Total | 25ul |
94°C | 10 min | |
94°C | 1 min | 24X |
55°C | 1min | 24X |
72°C | 1 min | 24X |
72°C | 10 min | |
4°C |
- Pega colônia com palito e coloca na água, depois acrescenta o mix
- Eletroforese fragmento 1500 pb
- 0,8-1% agarose em TBE 0,5X
- Cubeta pequena: 25 mL
- Syber Safe: 0,5 µL
- 100 V
- Eletroforese para cortar da banda do gel
- 0,8-1% agarose em TBE 0,5X
- Cubeta grande: 90 mL
- Syber Safe: 1 µL
- Aplicar o volume de duas reações de PCR por poço (50 µL + 4 µL tampão de amostra)
- 100V
[editar] Purificação de DNA da banda do gel
- Dissolvendo a banda do gel
- Após a eletroforese, excisar a banda do gel e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (pesa o tubo antes e depois para saber o peso do gel)
- Adicionar 10 µL da solução Membrane Binding para cada 10 mg da banda do gel. Vortex e incubar a 50-65 °C até que dissolva completamente. (Max. 350 mg de gel ou 40 µg DNA/membrana).
- Ligação do DNA
- Inserir minicoluna SV dentro de tudo coletor.
- Transferir mistura de gel dissolvida. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
- Centrifugar a 16000 x g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna no tubo coletor.
- Lavagem
- Adicionar 700 µL da Solução Membrane Wash (adicionado de etanol). Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna dentro do tubo coletor.
- Repetir o passo 4 com 500 µL de solução Membrane Wash. Centrifugar a 16000 g por 5 min (13400 rpm por 8 min).
- Esvaziar o tubo de coleta e recentrifugar a minicoluna + tubo coletor por 1 min com a tampa aberta para permitir a evaporação do etanol residual.
- Eluição
- Cuidadosamente transferir a minicoluna para um tubo de microcentrifuga 1,5 mL.
- Adicionar 50 µL (20 µL) de água livre de nuclease para minicoluna. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min).
- Descartar a minicoluna e estocar o DNA a 4 °C ou a -20 °C.
[editar] Concentrar DNA
O volume final do DNA eluído será de 100 µL. O DNA deve ser concentrado pela adição de 4 µL de NaCl 5M e invertido 3-5 vezes para misturar. Posteriormente adicionar 200 µL de etanol frio 100% e inverte 3-5 vezes para misturar. Centrifugar a 10000 g por 5 min a temperatura ambiente. Decanta todo o liquido. Remover o tanol residual em um dessecador, speed vácuo ou secar ao ar. Ressuspender o DNA precipitado em água estéril ou tris 10 mM estéril.
Secar DNA em termomixer a 40°C por 3 hrs.
[editar] Reação de ligação
Calcular a quantidade de DNA na reação de ligação (3:1, 5:1, 8:1)
{ [qtde de vetor (ng) x tamanho do inserto (kb)]/tamanho do vetor (kb) } x { razão molar x [inserto/vetor]} = inserto (ng)
[editar] Protocolo de ligação
- Centrifugar o vetor e o DNA controle para coletar do fundo do tubo
- Usar tubos de 0,5 mL
- Agitar em vortex o tampão de ligação 2X antes de cada uso
- Preparar alíquotas do tampão
- Misturar a reação por pipetagem
- Incubar a reação por 1 hora a temperatura ambiente (24 °C) ou por 16 hs a 4 °C.
Obs: Se usar o tampão de ligação 10X acrescenta no tubo de ligação apenas 1 µL desse tampão, podendo completar o volume final com água ou mais DNA.
Reagente | Reação (µL) | Controle + (µL) | Controle background |
Tampão de ligação 2X | 5 | 5 | 5 |
Vetor p-Gem-Easy | 1 | 1 | 1 |
Produto de PCR X | - | - | |
DNA controle | - | 2 | - |
T4 DNA ligase (30U/ µL) | 1 | 1 | 1 |
Água q.s.p. | 10 | 10 | 10 |
[editar] Transformação usando pGEM-T Easy vetor
- Remover tubos da E. coli (50 µL) mantidas a -80 °C e colocar em um banho de gelo até descongelar (aproximadamente 5 min). Misturar as células batendo gentilmente no tubo.
- Centrifugar os tubos contendo as reações de ligação para coletar o conteúdo do fundo do tubo. Adicionar 2 µL de cada reação de ligação para tubos contendo a E. coli. Gentilmente agite os tubos (devagar) para misturar a reação.
[editar] Protocolo de eletroporação
- Antes de tudo, as cubetas devem estar previamente resfriadas (mantidas tb no gelo) até a eletroporação.
- Transferir conteúdo preparado anteriormente para cubetas de eletroporação
- De forma asséptica quando misturar as células e a ligação, coletar cuidadosamente e colocar no fundo da cubeta (4 e 2 mm)
- Levar a cubeta ao eletroporador, ajustar a voltagem a 2500V e dar um pulso, vai aparecer a voltagem real que foi alcançada.
- Dar outro pulso sem a cubeta para o eletroporador ficar pronto para uma nova amostra.
- Após eletroporação, adicionar rapidamente à cubeta de eletroporação 900 µL do meio SOC previamente aquecido a 37 °C.
- Pipetar gentilmente de 3-4x, com pipeta de 1 mL para ressuspensão das células, e transferir para tubo Falcon de 15 mL estéril
- Deixar sob agitação a 150 rpm, 37 °C por 1,5 h.
Se usar uma cubeta de 1 mm usar voltagem de 1800V.
[editar] Protocolo de quimiotransformação
- Coloque o tubo contendo a mistura de células e ligação em gelo por 20 minutos e depois aqueça apor 45-50 segundos em banho-maria a 42ºC (sem agitação) e retorne os tubos imediatamente ao gelo por 2 minutos.
- Após a transformação, adicione 950 µl de meio SOC a temperatura ambiente aos tubos contendo as células transformadas.
- Incube por 1,5 h a 37ºC a 150 rpm.
[editar] Protocolo de plaqueamento dos clones
- Após a transformação plaquei 100 µl da cada cultura transformada em duplicata em placas com antibiótico. Se alto nº de colônias é requerido, as células podem ser centrifugadas 1000g/10min, ressuspendida em 200 µL de meio SOC e plaquei 100 µl em cada placa
- Incube as placas overnight (16-24h) a 37ºC (± 100 colônias/placa)
- Incubar as placas a 4ºC para facilitar a seleção de colônias azuis das brancas.
[editar] Meios de cultura
- Meio SOB (100 mL)
- Triptona: 2 g
- Extrato de levedura: 0,5 g
- NaCl: 0,05 g
- Adicionar parte da água e agitar até dissolver
- Adicionar 1 mL de KCl 250 mM
- Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5N
- Ajustar o volume para 100 mL
- Autoclavar e quando esfriar adicionar 0,5 mL de MgCl2 2 M ou 1mL de MgCl2 1M.
- Meio SOC (10 mL)
- Adicionar 180 µL de glicose 20% estéril
- IPTG
- 0,5 mM (concentração final)
- Estoque 0,1 M
- 1,2 g de IPTG em 50 mL de água milli-Q. Filtrar e estocar a 4 °C
- Ampicilina
- 100 µg/mL (concentração final) - dissolvido em água milli-Q, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C
- X-gal
- 80 µg/mL (concentração final) - dissolvido em dimetilformamida, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C.
- Composição TBE (Tris-Borato-EDTA) 5X
- 54 g Tris
- 27,5 g de ácido bórico
- 3,72 g EDTA
- Água q.s.p. 1L
- pH 8,0
- Composição TA (tampão de amostra) 6X
- Azul de bromofenol 0,25% p/v
- Glicerol 30%
- TE
- pH 8,0
- Para 10 mL: 3 mL de glicerol e 0,025 g de azul de bromofenol. Completa com TE até o volume de 10 mL.
- Composição TE (Tris-EDTA)
- Tris 10 mM
- EDTA 1 mM
- pH 7,8 - 8,0
- Para 100 mL: 0,121 g Tris (MM: 121,1) e 0,0326 g de EDTA (MM: 326). Adiciona água milli-Q até completar o volume para :100 mL.
- Preparo de marcador 1Kb DNA ladder (1 mL)
- 75 µL de DNA padrão
- 501 µL de tampão TA 6X
- 12 µL de NaCl 5 M
- 412 µL de água milli-Q
- Misturar tudo e aliquotar.
[editar] Observações e FAQ
A bóia possui posição específica: o anel interno deve ficar para baixo; caso conntrário o equipamento não funcionará