Preparo de plasmídeos - Microplacas
De Lembiotech Wiki
(Diferença entre revisões)
(Criou página com ';CUIDADOS ESPECIAIS :Observar atentamente a orientação das placas. :Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes. :Etiquetar cada...') |
(→MINI-PREP EM MICROPLACAS) |
||
(7 edições intermediárias de um usuário não apresentadas) | |||
Linha 4: | Linha 4: | ||
:Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência. | :Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência. | ||
− | ==PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS(96-well)Crescimento== | + | ==PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS (96-well) Crescimento== |
'''Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)''' | '''Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)''' | ||
Linha 11: | Linha 11: | ||
#*250 mL de meio é suficiente para duas placas | #*250 mL de meio é suficiente para duas placas | ||
#Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo | #Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo | ||
− | Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 | + | Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 uL de estoque para 1 mL de meio) |
#Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA) | #Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA) | ||
#Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC | #Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC | ||
Linha 22: | Linha 22: | ||
==MINI-PREP EM MICROPLACAS== | ==MINI-PREP EM MICROPLACAS== | ||
− | |||
#Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado | #Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado | ||
#*1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro | #*1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro | ||
Linha 28: | Linha 27: | ||
#Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA | #Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA | ||
#Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário). | #Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário). | ||
− | #Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células. | + | #Adicionar a cada poço 240 µL de [[#GET|GET]], selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células. |
− | + | ||
− | + | ||
#Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células. | #Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células. | ||
#Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min. | #Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min. | ||
− | #Adicionar a cada poço 80 µL de GET já contendo RNAse (preparar 20 mL de GET + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células. | + | #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#GET|GET]] já contendo RNAse (preparar 20 mL de [[#GET|GET]] + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células. |
#Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células | #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células | ||
− | #Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1% | + | #Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de [[#GET|GET]] + células para uma placa de fundo U |
+ | #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#SDS-NAOH|NaOH]] 0,2N / [[#SDS-NAOH|SDS]] 1% | ||
#*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser estocada | #*Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser estocada | ||
− | #*1 mL NaOH 4M + 2 mL SDS 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas). | + | #*1 mL [[#SDS-NAOH|NaOH]] 4M + 2 mL [[#SDS-NAOH|SDS]] 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução p/ 2 placas). |
− | #*Não pode ser adicionada uma solução de NaOH após SDS 10%, use água como intermediário. | + | #*Não pode ser adicionada uma solução de [[#SDS-NAOH|NaOH]] após [[#SDS-NAOH|SDS]] 10%, use água como intermediário. |
#Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão. | #Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão. | ||
#*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão. | #*Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão. | ||
#Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo. | #Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo. | ||
− | #Adicionar a cada poço 80 µL de acetato de potássio 3M (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão | + | #Adicionar a cada poço 80 µL de [[#ACETATO| acetato de potássio 3M]] (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão |
#Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm. | #Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm. | ||
#Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo | #Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo | ||
− | #Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min. | + | #Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por '''EXATOS''' 30 min. |
#Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC | #Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC | ||
#Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”). | #Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”). | ||
Linha 59: | Linha 57: | ||
#Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’. | #Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’. | ||
#Guardar placa no freezer – 20oC. | #Guardar placa no freezer – 20oC. | ||
− | |||
==SOLUÇÕES== | ==SOLUÇÕES== | ||
− | ;GET | + | ;<div id="GET">GET</div> |
:Glicose 50 mM filtrada | :Glicose 50 mM filtrada | ||
:EDTA 10mM pH 8,0 | :EDTA 10mM pH 8,0 | ||
Linha 70: | Linha 67: | ||
:Autoclavar 121 °C; 15 min | :Autoclavar 121 °C; 15 min | ||
− | ;SDS - NaOH | + | ;<div id="SDS-NAOH">SDS - NaOH</div> |
− | :SDS 10% - 300 | + | :SDS 10% - 300 uL |
− | :NaOH 4M – 150 | + | :NaOH 4M – 150 uL |
:H2O q.s.p. 3 mL | :H2O q.s.p. 3 mL | ||
− | ;Acetato de potássio 3M (KOAc) | + | ;<div id="ACETATO">Acetato de potássio 3M (KOAc)</div> |
:Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g) | :Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g) | ||
:Ácido acético glacial – 11,5 mL | :Ácido acético glacial – 11,5 mL |
Edição atual tal como 11h57min de 2 de abril de 2012
- CUIDADOS ESPECIAIS
- Observar atentamente a orientação das placas.
- Observar a troca das ponteiras que estão sendo usadas quando se está transferindo volumes.
- Etiquetar cada placa que será utilizada, de acordo com a seqüência.
[editar] PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS (96-well) Crescimento
Quando for fazer cultura estoque + miniprep, crescer 1,2 mL de cultura (200 µL para estoque + 1,0 mL para miniprep)
- Encher cada poço de um bloco de crescimento de 96 poços com 1,0 mL de meio Circle Grow contendo o antibiótico adequado, se necessário.
- 250 mL de meio é suficiente para duas placas
- Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo
Se utilizar as colônias das placas estoques (c/ glicerol), inocular usando o replicador molhando as pontas do replicador por três vezes e colocando no meio, ou use a pipeta multi-canal (12 uL de estoque para 1 mL de meio)
- Incubar a 37ºC, 200 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento é crítico para o rendimento adequado de DNA)
- Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (160 µL de bactéria + 40 µL de glicerol 50% estéril). Congelar em nitrogênio liquido. Estoque: guardar no freezer –80ºC
- Marcar a placa com fita crepe contendo
- Nome do responsável
- Nº da placa
- Biblioteca.
- Selar a placa com adesivo
[editar] MINI-PREP EM MICROPLACAS
- Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado
- 1 placa fundo “U”, 1 placa fundo “V” e 1 placa filtro
- Fixar com fita adesiva, uma placa Millipore (MAGV N22) no topo de uma microplaca de fundo em “V” de 250 µL de polipropileno. Verificar se os poços estão alinhados.
- Centrifugar as placas por 10 minutos, 4000 rpm, TA
- Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. (Depois disto pode ser mantida a –20ºC O/N, se for necessário).
- Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo e agitar (Vortex) por 5 min, para ressuspender bem as células.
- Centrifugar 10 min, 4000 rpm, TA, até sedimentar as células.
- Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 3 min.
- Adicionar a cada poço 80 µL de GET já contendo RNAse (preparar 20 mL de GET + 840µL de RNAse A 10 mg/mL; é suficiente para 2 placas). Selar as placas com adesivo e agitar (Vortex), para ressuspender as células.
- Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células
- Transferir, com o auxilio da pipeta multicanal, o a solução de GET + células para uma placa de fundo U
- Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1%
- Selar bem a placa com um novo adesivo e misturar 30 vezes por inversão.
- Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.
- Incubar por (no máximo) 5 min em TA. Spin por alguns segundos até que não fique solução no adesivo.
- Adicionar a cada poço 80 µL de acetato de potássio 3M (estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão
- Incubar por 10 min no gelo. Pulsar até chegar a 4000 rpm.
- Breve centrifugação (10 segundos - spin) para decantar a suspensão de células, até que não fique suspensão no adesivo
- Remover o adesivo e incubar a placa aberta em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min.
- Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 10 min, 4000 rpm, 20ºC
- Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a tampa) por 5 min 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”).
- Caso centrifugada por muito mais de 5 min a 4000rpm a placa Millipore corre o risco de rachar.
- Remover e descartar a placa Millipore. Adicionar 100 µL de Isopropanol ao filtrado (que está na microplaca de fundo V)
- Selar bem a placa com novo adesivo (resistente a álcool) e misturar 30 vezes por inversão.
- Centrifugar por 45 min, 4000 rpm, 20ºC.
- Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante (invertendo a placa)
- Adicione 200 µL de Etanol 70% gelado.
- Centrifugar por 5 min, 4000 rpm a 20ºC. Remova o sobrenadante.
- Inverter a placa sobre papel absorvente e pulsar, 600 rpm, 20ºC.
- Deixar a placa secar em TA por 60 min, coberta com papel toalha.
- Ressuspender o DNA com 100 µL de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘overnight’.
- Guardar placa no freezer – 20oC.
[editar] SOLUÇÕES
- GET
- Glicose 50 mM filtrada
- EDTA 10mM pH 8,0
- Tris-HCl 25 mM pH 7,4
- Para 500 mL
- 10 mL de EDTA 0,5M + 12,5 mL de Tris-HCl 1M + 22,5 mL glicose 20% + H2O q.s.p. 500 mL;
- Autoclavar 121 °C; 15 min
- SDS - NaOH
- SDS 10% - 300 uL
- NaOH 4M – 150 uL
- H2O q.s.p. 3 mL
- Acetato de potássio 3M (KOAc)
- Acetato de potássio 5M – 60 mL (ou pesar 29,44 g)
- Ácido acético glacial – 11,5 mL
- H2O Milli-Q autoclavada q.s.p. 100 mL
- Filtrar em papel de filtro com funil;
- Armazenar a solução em frasco de plástico
- Para preparar a solução estoque de Acetato de Potassio 5 M
- 246,87 g de KOAc em H2O q.s.p. para 500 mL.
- Filtrar em papel de filtro