DGGE - Passo a passo

Edição de 14h37min de 5 de setembro de 2011

Procedimentos

Montagem do Sistema

Limpar as placas de vidro utilizadas na montagem do gel (uma maior e outra menor) com álcool 100%. É recomendável que as placas não sejam limpas utilizando detergente na sua lavagem (somente água e esponja macia). Colocar entre as placas os espaçadores laterais de maneira que eles fiquem alinhados nas margens das placas e encaixar as placas nos sulcos dos grampos direito e esquerdo com as flechas apontando para cima e em direção as placas de vidro segurando firmemente. Em seguida, apoiar na superfície da bancada o sistema e ajustar os parafusos superiores dos grampos uniformemente até manter as placas fixas. Afrouxar um pouco os parafusos superiores, colocar o espaçador na parte superior para verificada a pressão ideal entre as duas placas e acochar os parafusos até a pressão máxima sem forçar. Utiliza-se um molde do gel em cartão para verificar se a pressão foi ideal entre as duas placas. É importante sempre manter alinhadas as placas para evitar vazamentos nas próximas etapas.

Após montado o “sanduíche” com as placas, ele deve ser colocado no suporte branco com a placa menor para frente. Pressionar o sistema contra a borracha vedante inferior encaixando e girando as presilhas desse suporte para baixo. Adicionar água Milli-Q no sistema, verificar a ocorrência de vazamento, descartar a água invertendo com cuidado o sistema na pia e secar o espaço entre as placas utilizando papel de filtro.

Confecção do Gel

Colocar as soluções desnaturantes a 37°C para dissolver os cristais da solução 100% formados pela estocagem a 4°C. Cada uma das soluções que constituirá o gel é colocada em um Tubo Falcon. Em um recipiente com gelo colocar os tubos Falcon “low” e “high”, que representam as soluções de menor e maior porcentagem de desnaturação do gradiente que deseja ser formado. Aliquotar as soluções 0% e 100% desnaturante de acordo com a tabela de gradiente de desnaturação de gel. Em seguida, adicionar 150 uL da solução de persulfato de amônio 10% e 14 uL de TEMED em cada tubo. Os tubos devem ser agitados invertendo-os várias vezes.

Após tem-se 8 min para realizar todo o processo de confecção do gel antes que a poliacrilamida polimerize. Usando-se as seringas nomeadas “low” e “high” sugar com a mangueira as soluções dos respectivos tubos para dentro da seringa, de modo que não se formem bolhas. As seringas devem está totalmente limpas. Acoplar as seringas ao aparelho que formará o gradiente desnaturante ao longo do gel, acochar os parafusos do sistema, acoplar os tubos das seringas a conexão “Y”, posicionar a ponteira por onde irá sair o gel entre as placas e girar a roda no sentido anti-horário lentamente de forma continua para formar o gradiente no gel. Posicionar o pente para formação dos poços e esperar 1h para completa polimerização do gel. Após aplicar as soluções no sistema lavar as seringas e todas as conexões para evitar entupimento e colocar para secar.

OBS: A acrilamida é uma sustância neurotóxica. Evitar o contato com a pele e usar sempre luvas.

Tampão de Corrida

Aliquotar 140 mL do tampão TAE 50X e completar com água para 7L. Transferir o tampão TAE 1X para o tanque do sistema do DCode e ligar o equipamento para aquecer. Configurar a temperatura para 70°C apesar da corrida ser a 60°C, devido ao fato de no momento da aplicação das amostras o tampão esfriar.

Montagem da Cuba de Tampão Superior

Após a polimerização do gel no sistema sanduíche, soltar o sistema do suporte branco e retirar os pentes da parte superior do gel.

Com a placa de vidro menor direcionada para o “core” posicionar o sanduíche de gel de forma que os pinos localizados lateralmente no “core” se encaixem nos sulcos das faces externas do sanduíche. Com os dedos segurar o “core” e os polegares apoiar a parte inferior dos grampos do sanduíche, empurrar o sanduíche de gel para baixo em direção ao “core”. Um “click” deve ser ouvido. Virar o “core” do outro lado e repetir o procedimento para acoplar o segundo sanduíche.

Checar o contato entre a borracha branca e a placa menor interna a fim de confirmar o posicionamento correto da placa formando um tanque. A instalação inapropriada do sanduíche de gel pode resultar em vazamento de tampão durante a corrida. Adicionar 350 mL de tampão de corrida na cuba de tampão superior e checar a vedação da cuba superior. Se o tampão estiver vazando despejar o tampão em um Becker, remover os sanduíches de gel e remontar o sistema.

Tanque de Eletroforese

Desligar o sistema Dcode, remover e colocar o módulo controlador de temperatura no suporte preto de metal. Colocar o “core” com os sanduíches dentro do tanque de eletroforese posicionando o botão vermelho sempre do lado direito e o botão preto do lado esquerdo do sistema. Adicionar 350 mL de tampão no tanque superior.

Aplicação das Amostras

Antes de aplicar as amostras utilizando-se uma pipeta deve-se dispensar tampão dentro dos poços para lavar e retirar os resíduos de poliacrilamida.

Preparar as amostras misturando-se em um microtubo o produto de PCR e o tampão de amostra na proporção 5:1 e aplicar em seus respectivos poços. Colocar o módulo controlador de temperatura sobre o tanque de eletroforese, ligar o aparelho (força, bomba e aquecedor), configurar a temperatura para 60°C, esperar atingir a temperatura e conectar o equipamento a fonte de eletroforese com a voltagem desejada (200V/3,5h).

Remoção do Gel

Ao término da corrida, desligar o aparelho, remover o módulo controlador de temperatura, deixar o sistema esfriar por 1 min no tampão e colocá-lo no suporte preto.

Remover o “core” dispensando o excesso de tampão dentro do tanque de eletroforese e colocá-lo na bancada deitado. Remover o sanduíche de gel com os dedos indicadores empurrando a parte inferior dos grampos para cima e com os polegares pressionando as alças pretas do “core” para baixo, até desencaixá-lo. Puxar o sanduíche de placas gentilmente para cima de maneira oposta àquela que ele foi encaixado ao “core”. Afrouxar os parafusos de cada grampo e remover os grampos do sanduíche. Retirar os espaçadores e descolar cuidadosamente as placas de vidro. Retirar os géis dentro de uma bandeja “lavando-os” com água para que desgrudem das placas e, assim, evitar que rasguem. Proceder com a coloração desejada.

Soluções

Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)

• Filtrar a solução utilizando membrana de 0,45 µm e estocar a 4°C.

Tampão TAE - 50X

• Misturar e autoclavar por 20 min a 110°C. Estocar a temperatura ambiente.

Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento

Solução Desnaturante 0%

• Misturar os componentes e filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Estocar a 4°C em garrafa escura por no máximo 1 mês.

Solução Desnaturante 100%

Preparo da Solução Desnaturante 100% para gel 8% de Acrilamida/Bis

1. Adicionar 20 mL da solução estoque de Acrilamida/Bis e 5 mL de água Milli-Q em garrafa Schott.
2. Colocar a garrafa em banho-maria sob agitação a 37 °C e acrescentar aos poucos a uréia até dissolvê-la completamente.
3. Adicionar 2 mL do tampão TAE 50 X.
4. Por último, acrescentar 40 mL de formamida deionizada.
5. Conferir o volume e completar para 100 mL com água Milli-Q, caso seja necessário.
6. Deixar 10 min em repouso para desgaseificação e filtrar em membrana 0,45 µm.
7. Estocar a 4°C em garrafa escuro por no máximo 1 mês.

Solução de Persulfato de Amônio 10%

• Estocar no escuro a -20ºC por uma semana

Tampão de amostra 2X

• Estocar a temperatura ambiente

Tampão de Corrida TAE 1X

Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE

• Cálculos realizados para um volume de 16 mL por seringa (gel 16 X16 cm com 1 mm de espessura).

Protocolos