DGGE - Passo a passo

Edição atual tal como 15h31min de 5 de setembro de 2011

[editar] Procedimentos

[editar] Montagem do Sistema

Limpar as placas de vidro utilizadas na montagem do gel (uma maior e outra menor) com álcool 100%. É recomendável que as placas não sejam limpas utilizando detergente na sua lavagem (somente água e esponja macia). Colocar entre as placas os espaçadores laterais de maneira que eles fiquem alinhados nas margens das placas e encaixar as placas nos sulcos dos grampos direito e esquerdo com as flechas apontando para cima e em direção as placas de vidro segurando firmemente. Em seguida, apoiar na superfície da bancada o sistema e ajustar os parafusos superiores dos grampos uniformemente até manter as placas fixas. Afrouxar um pouco os parafusos superiores, colocar o espaçador na parte superior para verificada a pressão ideal entre as duas placas e acochar os parafusos até a pressão máxima sem forçar. Utiliza-se um molde do gel em cartão para verificar se a pressão foi ideal entre as duas placas. É importante sempre manter alinhadas as placas para evitar vazamentos nas próximas etapas.

Após montado o “sanduíche” com as placas, ele deve ser colocado no suporte branco com a placa menor para frente. Pressionar o sistema contra a borracha vedante inferior encaixando e girando as presilhas desse suporte para baixo. Adicionar água Milli-Q no sistema, verificar a ocorrência de vazamento, descartar a água invertendo com cuidado o sistema na pia e secar o espaço entre as placas utilizando papel de filtro.

[editar] Confecção do Gel

Colocar as soluções desnaturantes a 37°C para dissolver os cristais da solução 100% formados pela estocagem a 4°C. Cada uma das soluções que constituirá o gel é colocada em um Tubo Falcon. Em um recipiente com gelo colocar os tubos Falcon “low” e “high”, que representam as soluções de menor e maior porcentagem de desnaturação do gradiente que deseja ser formado. Aliquotar as soluções 0% e 100% desnaturante de acordo com a tabela de gradiente de desnaturação de gel. Em seguida, adicionar 150 uL da solução de persulfato de amônio 10% e 14 uL de TEMED em cada tubo. Os tubos devem ser agitados invertendo-os várias vezes.

Após tem-se 8 min para realizar todo o processo de confecção do gel antes que a poliacrilamida polimerize. Usando-se as seringas nomeadas “low” e “high” sugar com a mangueira as soluções dos respectivos tubos para dentro da seringa, de modo que não se formem bolhas. As seringas devem está totalmente limpas. Acoplar as seringas ao aparelho que formará o gradiente desnaturante ao longo do gel, acochar os parafusos do sistema, acoplar os tubos das seringas a conexão “Y”, posicionar a ponteira por onde irá sair o gel entre as placas e girar a roda no sentido anti-horário lentamente de forma continua para formar o gradiente no gel. Posicionar o pente para formação dos poços e esperar 1h para completa polimerização do gel. Após aplicar as soluções no sistema lavar as seringas e todas as conexões para evitar entupimento e colocar para secar.

OBS: A acrilamida é uma sustância neurotóxica. Evitar o contato com a pele e usar sempre luvas.

[editar] Tampão de Corrida

Aliquotar 140 mL do tampão TAE 50X e completar com água para 7L. Transferir o tampão TAE 1X para o tanque do sistema do DCode e ligar o equipamento para aquecer. Configurar a temperatura para 70°C apesar da corrida ser a 60°C, devido ao fato de no momento da aplicação das amostras o tampão esfriar.

[editar] Montagem da Cuba de Tampão Superior

Após a polimerização do gel no sistema sanduíche, soltar o sistema do suporte branco e retirar os pentes da parte superior do gel.

Com a placa de vidro menor direcionada para o “core” posicionar o sanduíche de gel de forma que os pinos localizados lateralmente no “core” se encaixem nos sulcos das faces externas do sanduíche. Com os dedos segurar o “core” e os polegares apoiar a parte inferior dos grampos do sanduíche, empurrar o sanduíche de gel para baixo em direção ao “core”. Um “click” deve ser ouvido. Virar o “core” do outro lado e repetir o procedimento para acoplar o segundo sanduíche.

Checar o contato entre a borracha branca e a placa menor interna a fim de confirmar o posicionamento correto da placa formando um tanque. A instalação inapropriada do sanduíche de gel pode resultar em vazamento de tampão durante a corrida. Adicionar 350 mL de tampão de corrida na cuba de tampão superior e checar a vedação da cuba superior. Se o tampão estiver vazando despejar o tampão em um Becker, remover os sanduíches de gel e remontar o sistema.

[editar] Tanque de Eletroforese

Desligar o sistema Dcode, remover e colocar o módulo controlador de temperatura no suporte preto de metal. Colocar o “core” com os sanduíches dentro do tanque de eletroforese posicionando o botão vermelho sempre do lado direito e o botão preto do lado esquerdo do sistema. Adicionar 350 mL de tampão no tanque superior.

[editar] Aplicação das Amostras

Antes de aplicar as amostras utilizando-se uma pipeta deve-se dispensar tampão dentro dos poços para lavar e retirar os resíduos de poliacrilamida.

Preparar as amostras misturando-se em um microtubo o produto de PCR e o tampão de amostra na proporção 5:1 e aplicar em seus respectivos poços. Colocar o módulo controlador de temperatura sobre o tanque de eletroforese, ligar o aparelho (força, bomba e aquecedor), configurar a temperatura para 60°C, esperar atingir a temperatura e conectar o equipamento a fonte de eletroforese com a voltagem desejada (200V/3,5h).

[editar] Remoção do Gel

Ao término da corrida, desligar o aparelho, remover o módulo controlador de temperatura, deixar o sistema esfriar por 1 min no tampão e colocá-lo no suporte preto.

Remover o “core” dispensando o excesso de tampão dentro do tanque de eletroforese e colocá-lo na bancada deitado. Remover o sanduíche de gel com os dedos indicadores empurrando a parte inferior dos grampos para cima e com os polegares pressionando as alças pretas do “core” para baixo, até desencaixá-lo. Puxar o sanduíche de placas gentilmente para cima de maneira oposta àquela que ele foi encaixado ao “core”. Afrouxar os parafusos de cada grampo e remover os grampos do sanduíche. Retirar os espaçadores e descolar cuidadosamente as placas de vidro. Retirar os géis dentro de uma bandeja “lavando-os” com água para que desgrudem das placas e, assim, evitar que rasguem. Proceder com a coloração desejada.

[editar] Soluções

[editar] Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)

• Filtrar a solução utilizando membrana de 0,45 µm e estocar a 4°C.

[editar] Tampão TAE - 50X

• Misturar e autoclavar por 20 min a 110°C. Estocar a temperatura ambiente.

[editar] Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento

[editar] Solução Desnaturante 0%

• Misturar os componentes e filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Estocar a 4°C em garrafa escura por no máximo 1 mês.

[editar] Solução Desnaturante 100%

Preparo da Solução Desnaturante 100% para gel 8% de Acrilamida/Bis

1. Adicionar 20 mL da solução estoque de Acrilamida/Bis e 5 mL de água Milli-Q em garrafa Schott.
2. Colocar a garrafa em banho-maria sob agitação a 37 °C e acrescentar aos poucos a uréia até dissolvê-la completamente.
3. Adicionar 2 mL do tampão TAE 50 X.
4. Por último, acrescentar 40 mL de formamida deionizada.
5. Conferir o volume e completar para 100 mL com água Milli-Q, caso seja necessário.
6. Deixar 10 min em repouso para desgaseificação e filtrar em membrana 0,45 µm.
7. Estocar a 4°C em garrafa escuro por no máximo 1 mês.

[editar] Solução de Persulfato de Amônio 10%

• Estocar no escuro a -20ºC por uma semana

[editar] Tampão de amostra 2X

• Estocar a temperatura ambiente

[editar] Tampão de Corrida TAE 1X

[editar] Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE

• Cálculos realizados para um volume de 16 mL por seringa (gel 16 X16 cm com 1 mm de espessura).

[editar] Protocolos

[editar] Protocolo PCR (rRNA 16S Bacteria)

[editar] Protocolo PCR (rRNA 16S Achaea)

[editar] Protocolo PCR de colônia

• Pega colônia com palito e coloca na água, depois acrescenta o mix

Eletroforese fragmento 1500 pb

0,8-1% agarose em TBE 0,5X

Cubeta pequena: 25 mL

Syber Safe: 0,5 µL

100 V

Eletroforese para cortar da banda do gel

0,8-1% agarose em TBE 0,5X

Cubeta grande: 90 mL

Syber Safe: 1 µL

Aplicar o volume de duas reações de PCR por poço (50 µL + 4 µL tampão de amostra)

100V

[editar] Purificação de DNA da banda do gel

Dissolvendo a banda do gel

1. Após a eletroforese, excisar a banda do gel e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (pesa o tubo antes e depois para saber o peso do gel)
2. Adicionar 10 µL da solução Membrane Binding para cada 10 mg da banda do gel. Vortex e incubar a 50-65 °C até que dissolva completamente. (Max. 350 mg de gel ou 40 µg DNA/membrana).

Ligação do DNA

1. Inserir minicoluna SV dentro de tudo coletor.
2. Transferir mistura de gel dissolvida. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
3. Centrifugar a 16000 x g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna no tubo coletor.

Lavagem

1. Adicionar 700 µL da Solução Membrane Wash (adicionado de etanol). Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min). Descartar o sobrenadante e reinserir a minicoluna dentro do tubo coletor.
2. Repetir o passo 4 com 500 µL de solução Membrane Wash. Centrifugar a 16000 g por 5 min (13400 rpm por 8 min).
3. Esvaziar o tubo de coleta e recentrifugar a minicoluna + tubo coletor por 1 min com a tampa aberta para permitir a evaporação do etanol residual.

Eluição

1. Cuidadosamente transferir a minicoluna para um tubo de microcentrifuga 1,5 mL.
2. Adicionar 50 µL (20 µL) de água livre de nuclease para minicoluna. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a 16000 g por 1 min (13400 rpm por 2 min).
3. Descartar a minicoluna e estocar o DNA a 4 °C ou a -20 °C.

[editar] Concentrar DNA

O volume final do DNA eluído será de 100 µL. O DNA deve ser concentrado pela adição de 4 µL de NaCl 5M e invertido 3-5 vezes para misturar. Posteriormente adicionar 200 µL de etanol frio 100% e inverte 3-5 vezes para misturar. Centrifugar a 10000 g por 5 min a temperatura ambiente. Decanta todo o liquido. Remover o tanol residual em um dessecador, speed vácuo ou secar ao ar. Ressuspender o DNA precipitado em água estéril ou tris 10 mM estéril.

Secar DNA em termomixer a 40°C por 3 hrs.

[editar] Reação de ligação

Calcular a quantidade de DNA na reação de ligação (3:1, 5:1, 8:1)

{ [qtde de vetor (ng) x tamanho do inserto (kb)]/tamanho do vetor (kb) } x { razão molar x [inserto/vetor]} = inserto (ng)

[editar] Protocolo de ligação

1. Centrifugar o vetor e o DNA controle para coletar do fundo do tubo
2. Usar tubos de 0,5 mL
3. Agitar em vortex o tampão de ligação 2X antes de cada uso
   1. Preparar alíquotas do tampão
4. Misturar a reação por pipetagem
5. Incubar a reação por 1 hora a temperatura ambiente (24 °C) ou por 16 hs a 4 °C.

Obs: Se usar o tampão de ligação 10X acrescenta no tubo de ligação apenas 1 µL desse tampão, podendo completar o volume final com água ou mais DNA.

[editar] Transformação usando pGEM-T Easy vetor

1. Remover tubos da E. coli (50 µL) mantidas a -80 °C e colocar em um banho de gelo até descongelar (aproximadamente 5 min). Misturar as células batendo gentilmente no tubo.
2. Centrifugar os tubos contendo as reações de ligação para coletar o conteúdo do fundo do tubo. Adicionar 2 µL de cada reação de ligação para tubos contendo a E. coli. Gentilmente agite os tubos (devagar) para misturar a reação.

[editar] Protocolo de eletroporação

Antes de tudo, as cubetas devem estar previamente resfriadas (mantidas tb no gelo) até a eletroporação.

1. Transferir conteúdo preparado anteriormente para cubetas de eletroporação
2. De forma asséptica quando misturar as células e a ligação, coletar cuidadosamente e colocar no fundo da cubeta (4 e 2 mm)
3. Levar a cubeta ao eletroporador, ajustar a voltagem a 2500V e dar um pulso, vai aparecer a voltagem real que foi alcançada.
4. Dar outro pulso sem a cubeta para o eletroporador ficar pronto para uma nova amostra.
5. Após eletroporação, adicionar rapidamente à cubeta de eletroporação 900 µL do meio SOC previamente aquecido a 37 °C.
6. Pipetar gentilmente de 3-4x, com pipeta de 1 mL para ressuspensão das células, e transferir para tubo Falcon de 15 mL estéril
7. Deixar sob agitação a 150 rpm, 37 °C por 1,5 h.

Se usar uma cubeta de 1 mm usar voltagem de 1800V.

[editar] Protocolo de quimiotransformação

1. Coloque o tubo contendo a mistura de células e ligação em gelo por 20 minutos e depois aqueça apor 45-50 segundos em banho-maria a 42ºC (sem agitação) e retorne os tubos imediatamente ao gelo por 2 minutos.
2. Após a transformação, adicione 950 µl de meio SOC a temperatura ambiente aos tubos contendo as células transformadas.
3. Incube por 1,5 h a 37ºC a 150 rpm.

[editar] Protocolo de plaqueamento dos clones

1. Após a transformação plaquei 100 µl da cada cultura transformada em duplicata em placas com antibiótico. Se alto nº de colônias é requerido, as células podem ser centrifugadas 1000g/10min, ressuspendida em 200 µL de meio SOC e plaquei 100 µl em cada placa
2. Incube as placas overnight (16-24h) a 37ºC (± 100 colônias/placa)
3. Incubar as placas a 4ºC para facilitar a seleção de colônias azuis das brancas.

[editar] Meios de cultura

Meio SOB (100 mL)

• Triptona: 2 g
• Extrato de levedura: 0,5 g
• NaCl: 0,05 g

1. Adicionar parte da água e agitar até dissolver
2. Adicionar 1 mL de KCl 250 mM
3. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5N
4. Ajustar o volume para 100 mL
5. Autoclavar e quando esfriar adicionar 0,5 mL de MgCl2 2 M ou 1mL de MgCl2 1M.

Meio SOC (10 mL)

• Adicionar 180 µL de glicose 20% estéril

IPTG

0,5 mM (concentração final)

Estoque 0,1 M

1,2 g de IPTG em 50 mL de água milli-Q. Filtrar e estocar a 4 °C

Ampicilina

100 µg/mL (concentração final) - dissolvido em água milli-Q, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C

X-gal

80 µg/mL (concentração final) - dissolvido em dimetilformamida, coberto com papel alumínio e estocado a 20 °C.

Composição TBE (Tris-Borato-EDTA) 5X

54 g Tris

27,5 g de ácido bórico

3,72 g EDTA

Água q.s.p. 1L

pH 8,0

Composição TA (tampão de amostra) 6X

Azul de bromofenol 0,25% p/v

Glicerol 30%

TE

pH 8,0

Para 10 mL: 3 mL de glicerol e 0,025 g de azul de bromofenol. Completa com TE até o volume de 10 mL.

Composição TE (Tris-EDTA)

Tris 10 mM

EDTA 1 mM

pH 7,8 - 8,0

Para 100 mL: 0,121 g Tris (MM: 121,1) e 0,0326 g de EDTA (MM: 326). Adiciona água milli-Q até completar o volume para :100 mL.

Preparo de marcador 1Kb DNA ladder (1 mL)

75 µL de DNA padrão

501 µL de tampão TA 6X

12 µL de NaCl 5 M

412 µL de água milli-Q

Misturar tudo e aliquotar.

[editar] Observações e FAQ

A bóia possui posição específica: o anel interno deve ficar para baixo; caso conntrário o equipamento não funcionará