DGGE - Passo a passo

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|94°C||5 min
 
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Edição de 14h37min de 5 de setembro de 2011

Tabela de conteúdo

Procedimentos

Montagem do Sistema

Limpar as placas de vidro utilizadas na montagem do gel (uma maior e outra menor) com álcool 100%. É recomendável que as placas não sejam limpas utilizando detergente na sua lavagem (somente água e esponja macia). Colocar entre as placas os espaçadores laterais de maneira que eles fiquem alinhados nas margens das placas e encaixar as placas nos sulcos dos grampos direito e esquerdo com as flechas apontando para cima e em direção as placas de vidro segurando firmemente. Em seguida, apoiar na superfície da bancada o sistema e ajustar os parafusos superiores dos grampos uniformemente até manter as placas fixas. Afrouxar um pouco os parafusos superiores, colocar o espaçador na parte superior para verificada a pressão ideal entre as duas placas e acochar os parafusos até a pressão máxima sem forçar. Utiliza-se um molde do gel em cartão para verificar se a pressão foi ideal entre as duas placas. É importante sempre manter alinhadas as placas para evitar vazamentos nas próximas etapas.

Após montado o “sanduíche” com as placas, ele deve ser colocado no suporte branco com a placa menor para frente. Pressionar o sistema contra a borracha vedante inferior encaixando e girando as presilhas desse suporte para baixo. Adicionar água Milli-Q no sistema, verificar a ocorrência de vazamento, descartar a água invertendo com cuidado o sistema na pia e secar o espaço entre as placas utilizando papel de filtro.

Confecção do Gel

Colocar as soluções desnaturantes a 37°C para dissolver os cristais da solução 100% formados pela estocagem a 4°C. Cada uma das soluções que constituirá o gel é colocada em um Tubo Falcon. Em um recipiente com gelo colocar os tubos Falcon “low” e “high”, que representam as soluções de menor e maior porcentagem de desnaturação do gradiente que deseja ser formado. Aliquotar as soluções 0% e 100% desnaturante de acordo com a tabela de gradiente de desnaturação de gel. Em seguida, adicionar 150 uL da solução de persulfato de amônio 10% e 14 uL de TEMED em cada tubo. Os tubos devem ser agitados invertendo-os várias vezes.

Após tem-se 8 min para realizar todo o processo de confecção do gel antes que a poliacrilamida polimerize. Usando-se as seringas nomeadas “low” e “high” sugar com a mangueira as soluções dos respectivos tubos para dentro da seringa, de modo que não se formem bolhas. As seringas devem está totalmente limpas. Acoplar as seringas ao aparelho que formará o gradiente desnaturante ao longo do gel, acochar os parafusos do sistema, acoplar os tubos das seringas a conexão “Y”, posicionar a ponteira por onde irá sair o gel entre as placas e girar a roda no sentido anti-horário lentamente de forma continua para formar o gradiente no gel. Posicionar o pente para formação dos poços e esperar 1h para completa polimerização do gel. Após aplicar as soluções no sistema lavar as seringas e todas as conexões para evitar entupimento e colocar para secar.

OBS: A acrilamida é uma sustância neurotóxica. Evitar o contato com a pele e usar sempre luvas.

Tampão de Corrida

Aliquotar 140 mL do tampão TAE 50X e completar com água para 7L. Transferir o tampão TAE 1X para o tanque do sistema do DCode e ligar o equipamento para aquecer. Configurar a temperatura para 70°C apesar da corrida ser a 60°C, devido ao fato de no momento da aplicação das amostras o tampão esfriar.

Montagem da Cuba de Tampão Superior

Após a polimerização do gel no sistema sanduíche, soltar o sistema do suporte branco e retirar os pentes da parte superior do gel.

Com a placa de vidro menor direcionada para o “core” posicionar o sanduíche de gel de forma que os pinos localizados lateralmente no “core” se encaixem nos sulcos das faces externas do sanduíche. Com os dedos segurar o “core” e os polegares apoiar a parte inferior dos grampos do sanduíche, empurrar o sanduíche de gel para baixo em direção ao “core”. Um “click” deve ser ouvido. Virar o “core” do outro lado e repetir o procedimento para acoplar o segundo sanduíche.

Checar o contato entre a borracha branca e a placa menor interna a fim de confirmar o posicionamento correto da placa formando um tanque. A instalação inapropriada do sanduíche de gel pode resultar em vazamento de tampão durante a corrida. Adicionar 350 mL de tampão de corrida na cuba de tampão superior e checar a vedação da cuba superior. Se o tampão estiver vazando despejar o tampão em um Becker, remover os sanduíches de gel e remontar o sistema.

Tanque de Eletroforese

Desligar o sistema Dcode, remover e colocar o módulo controlador de temperatura no suporte preto de metal. Colocar o “core” com os sanduíches dentro do tanque de eletroforese posicionando o botão vermelho sempre do lado direito e o botão preto do lado esquerdo do sistema. Adicionar 350 mL de tampão no tanque superior.

Aplicação das Amostras

Antes de aplicar as amostras utilizando-se uma pipeta deve-se dispensar tampão dentro dos poços para lavar e retirar os resíduos de poliacrilamida.

Preparar as amostras misturando-se em um microtubo o produto de PCR e o tampão de amostra na proporção 5:1 e aplicar em seus respectivos poços. Colocar o módulo controlador de temperatura sobre o tanque de eletroforese, ligar o aparelho (força, bomba e aquecedor), configurar a temperatura para 60°C, esperar atingir a temperatura e conectar o equipamento a fonte de eletroforese com a voltagem desejada (200V/3,5h).

Remoção do Gel

Ao término da corrida, desligar o aparelho, remover o módulo controlador de temperatura, deixar o sistema esfriar por 1 min no tampão e colocá-lo no suporte preto.

Remover o “core” dispensando o excesso de tampão dentro do tanque de eletroforese e colocá-lo na bancada deitado. Remover o sanduíche de gel com os dedos indicadores empurrando a parte inferior dos grampos para cima e com os polegares pressionando as alças pretas do “core” para baixo, até desencaixá-lo. Puxar o sanduíche de placas gentilmente para cima de maneira oposta àquela que ele foi encaixado ao “core”. Afrouxar os parafusos de cada grampo e remover os grampos do sanduíche. Retirar os espaçadores e descolar cuidadosamente as placas de vidro. Retirar os géis dentro de uma bandeja “lavando-os” com água para que desgrudem das placas e, assim, evitar que rasguem. Proceder com a coloração desejada.

Soluções

Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)

Solução de Acrilamida/Bis (37,5 : 1)
Reagentes Quantidade
Acrilamida 38,93 g
Bis-Acrilamida 1,07 g
Água Milli-Q qsp. 100 mL
  • Filtrar a solução utilizando membrana de 0,45 µm e estocar a 4°C.

Tampão TAE - 50X

Tampão TAE - 50X
Reagente Quantidade Concentração Final
Tris Base 242 g 2 M
Ácido Acético Glacial 57,1 mL 1M
EDTA 0,5 M pH 8,0 100 mL 50 mM
Água Milli-Q Qsp. 1000 mL
  • Misturar e autoclavar por 20 min a 110°C. Estocar a temperatura ambiente.

Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento

Porcentagem de Acrilamida/Bis X Tamamanho do Fragmento
Porcentagem do Gel Tamanho do fragmento
6% 300-1000 pb
8% 200-400 pb
10% 100-300 pb


Solução Desnaturante 0%

Solução Desnaturante 0%
Reagentes 6% 8% 10% 12%
Acrilamida/Bis 40% 15ml 20ml 25 30ml
Tampão TAE 50X 2ml 2mm 2ml 2ml
Água Milli-Q 83ml 78ml 73ml 68ml
Volume total 100ml 100ml 100ml 100ml
  • Misturar os componentes e filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Estocar a 4°C em garrafa escura por no máximo 1 mês.


Solução Desnaturante 100%

Solução Desnaturante 100%
Reagentes 6% 8% 10% 12%
Acrilamida/Bis 40% 15ml 20ml 25 30ml
Tampão TAE 50X 2ml 2mm 2ml 2ml
Água Milli-Q 40ml 40ml 40ml 40ml
Uréia 42g 42g 42g 42g
Água Milli-Q qsp. 100ml qsp. 100ml qsp. 100ml qsp. 100ml


Preparo da Solução Desnaturante 100% para gel 8% de Acrilamida/Bis
  1. Adicionar 20 mL da solução estoque de Acrilamida/Bis e 5 mL de água Milli-Q em garrafa Schott.
  2. Colocar a garrafa em banho-maria sob agitação a 37 °C e acrescentar aos poucos a uréia até dissolvê-la completamente.
  3. Adicionar 2 mL do tampão TAE 50 X.
  4. Por último, acrescentar 40 mL de formamida deionizada.
  5. Conferir o volume e completar para 100 mL com água Milli-Q, caso seja necessário.
  6. Deixar 10 min em repouso para desgaseificação e filtrar em membrana 0,45 µm.
  7. Estocar a 4°C em garrafa escuro por no máximo 1 mês.

Solução de Persulfato de Amônio 10%

Solução de Persulfato de Amônio 10%
Reagente Quantidade
Persulfato de amônio 0,1g
Água Milli-Q 1,0ml
  • Estocar no escuro a -20ºC por uma semana

Tampão de amostra 2X

Tampão de amostra 2X
Reagente Quantidade Concentração final
Azul de bromofenol 2% 0,25ml 0,05%
Xileno Cianol 2% 0,25ml 0,05%
Glicerol 100% 70%
Água Milli-Q 2,5ml
Volume total 10ml
  • Estocar a temperatura ambiente

Tampão de Corrida TAE 1X

Tampão de Corrida TAE 1X
Reagente Quantidade
Tampão TAE 50X 140 mL
Água destilada 6860 mL
Volume Total 7000ml

Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE

Tabela de Gradiente de Desnaturação no Gel do DGGE
Conc. de Desnaturação Solução 0 % Desnaturante Solução 100 % Desnaturante
25% 12,0 mL 4,0 mL
30% 11,2 mL 4,8 mL
35% 10,4 mL 5,6 mL
40% 9,6 mL 6,4 mL
45% 8,8 mL 7,2 mL
50% 8,0 mL 8,0 mL
60% 6,4 mL 9,6 mL
65% 5,6 mL 10,4 mL
70% 4,8 mL 11,2 mL
75% 4,0 mL 12,0 mL
  • Cálculos realizados para um volume de 16 mL por seringa (gel 16 X16 cm com 1 mm de espessura).

Protocolos

Protocolo PCR (rRNA 16S Bacteria)
Concentração final 1 reação (µL)
PCR Buffer (5X) 5
MgCl2 (25mM) 2
dNTPs (10 mM) 0,5
Primer 27F (5 µM) 2,5
Primer 1525R (5 µM) 2,5
GoTaq (5U/µL) 0,2
Total mix por reação 12,7
DNA (10 ng) mais água 12,3
Total 25 µL
Programa Bacteria
94°C 5 min
94°C 1 min 24X
51°C 1min 24X
72°C 3 min 24X
72°C 10 min
4°C


Protocolo PCR (rRNA 16S Achaea)
Concentração final 1 reação (µL)
PCR Buffer (5X) 5
MgCl2 (25mM) 2
dNTPs (10 mM) 0,5
Primer 20F (5 µM) 1,5
Primer 958R (5 µM) 1,5
GoTaq (5U/µL) 0,2
Gelatina 1% 0,025
Total mix por reação 10,7
DNA (10 ng) mais água 14,3
Total 25 µL
Programa Archaea
94°C 5 min
94°C 0,5 min 30X
55°C 1min 30X
72°C 1 min 30X
72°C 10 min
4°C
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